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本课题组前期研究针对两头高乳蛋白率、乳脂率与两头低乳蛋白率、乳脂率的泌乳期中国荷斯坦奶牛的乳腺上皮组织进行了转录组测序(RNA-Seq),得到31个与脂肪和蛋白质代谢、乳腺生长发育相关的差异表达基因,并通过整合分析RNA-Seq、QTL、GWAS及生物学功能结果,最终将TRIB3,VEGFA,PTHLH和SAA家族基因确定为产奶性状重要候选功能基因。本研究旨在将这些差异基因与中国荷斯坦奶牛的产奶性状进行遗传效应分析、寻找关键致因突变并对候选关键基因进行功能验证。(1)候选基因与奶牛产奶性状的遗传效应分析：本研究选择21头中国荷斯坦公牛作为试验群体,利用混池测序对候选基因全部编码区及上游2000bp调控区进行SNP检测,共发现29个SNPs。通过SNaPshot、飞行时间质谱、PCR-RFLP多色荧光标记四种技术对717头中国荷斯坦牛群体进行基因型分型。与产奶性状单标记SNP关联分析结果表明,TRIB3和SAA家族基因都至少与2个产奶性状关联程度达到显著或者极显著水平(p<0.05或p<0.01),VEGFA和PTHLH基因检测到的SNPs与产奶性状关联均不显著。同时,单倍型分析的结果基本与单标记遗传分析的结果一致。另外,组织表达谱分析表明SAA3.2基因在乳腺组织中特异性高表达,而TRIB3基因在肝脏组织中特异性高表达。(2)关键突变位点的功能验证：针对遗传效应显著的5’调控区位点,通过在线预测软件TFSEARCH预测转录因子结合位点情况,并通过启动子区活性检测、凝胶阻滞试验(EMSA)和超迁移凝胶阻滞试验(super-shift EMSA)进行功能验证。结果表明：SAA1基因位点c.-1788C>T和c.-963C>A均检测到突变前后转录因子结合的改变,同时双荧光素酶活性分析结果也验证上述预测；SAA2基因的c.114G>A位点通过改变mRNA的二级结构和结合不同的转录因子影响启动子活性：SAA3.2基因的c.-1500A>G突变前后荧光素酶活性分析的改变最大,通过super-shift EMSA试验检测到C/EBPβ转录因子的结合；TRIB3基因中检测到一段52bp的增强子序列,并通过启动子活性分析进行验证。(3)TRIB3和SAA3.2基因的功能验证：MAC-T细胞系具有正常的乳腺上皮细胞的形态和特征,同时目的TRIB3和SAA3.2也在该细胞系中表达,适用于目的基因的功能验证。瞬时转染MAC-T细胞系,SAA3.2基因构建shRNA慢病毒表达载体的转染效率在70～80%,而TRIB3基因慢病毒过表达载体的转染效率在40～50%。转染72h检测TRIB3基因过表达和SAA3.2基因干扰后乳脂相关基因的表达情况,发现这些基因的表达趋势一致,表明在影响奶牛乳脂性状方面这两个基因的作用途径完全相反。同时,处理前后表达量变化最大的基因包含脂蛋白脂肪酶(LPL)基因、B类清道夫受体(CD36)、载脂蛋白1(APOA1)等参与乳脂转运的基因,表明这两个基因是通过参与乳脂的转运过程影响奶牛的相关乳脂性状。