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第一部分：IGF-1在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用研究目的：研究高糖培养的人永生化角膜上皮细胞(Human telomerase-immortalized corneal epithelial cells, THCE)及糖尿病大鼠角膜上皮中,高糖对创伤刺激的IGF-1及IGF-1R表达的影响,探讨外源性IGF-1对高糖培养的THCE细胞增殖、迁移、凋亡的影响及相关分子机制,阐明IGF-1在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用。方法：1.根据文献报道的THCE高糖干预模型,分别用5mM-45mM浓度的葡萄糖处理THCE细胞24h或48h,MTT法检测THCE细胞存活率,筛选合适的高糖浓度及作用时间。根据文献报道的外源性IGF-1干预浓度,分别用10-200ng/ml的IGF-1处理THCE细胞48h,MTT法检测THCE细胞存活率,筛选合适的IGF-1浓度。2.分别用5mM、25mM浓度的葡萄糖预处理THCE细胞48h,经生长因子饥饿12h后,收集未划伤及划伤后不同时间点的两组细胞及细胞培养上清,利用real-time PCR法检测IGF-1及IGF-1R mRNA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IGF-1蛋白水平,western blot分析IGF-1R蛋白表达,免疫荧光细胞化学法检测IGF-1、IGF-1R蛋白分布及表达。3.比较正常及糖尿病大鼠角膜上皮创伤愈合情况,研究创伤后角膜上皮中IGF-1、IGF-1R mRNA及蛋白的表达。4.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同时间点分别对5mM葡萄糖、25mmM葡萄糖、25mmM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞,利用MTT法检测细胞增殖能力；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；Annexin V-FITC/PI双荧光染色法+流式细胞仪检测细胞凋亡。5.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加IGF-1(50ng/ml)。于刺激后不同时间点分别收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞,利用real-time PCR法、western blot及免疫荧光细胞化学法检测增殖、迁移及凋亡相关因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表达。结果：1.制作高糖干预模型的合适条件为25mM浓度的葡萄糖处理THCE细胞48h。外源性添加IGF-1的合适浓度为50ng/ml。2.在正常或高糖培养的两组THCE细胞中,划伤可刺激IGF-1及IGF-1R mRNA表达上调；划伤后12及24h,高糖组IGF-1及IGF-1R mRNA表达显著低于正常组；划伤后24及48h,高糖组IGF-1及IGF-1R蛋白表达显著低于正常组；划伤后48h,高糖组IGF-1及IGF-1R荧光染色强度低于正常组。3.与正常大鼠相比,糖尿病大鼠角膜上皮创伤愈合显著延迟。伤后1,2,3天,糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R mRNA表达显著低于正常大鼠。伤后2,3天,糖尿病大鼠角膜上皮中IGF-1、IGF-1R荧光染色强度低于正常大鼠。4.高糖抑制THCE细胞存活率,下调增殖相关因子ki-67mRNA及蛋白表达。高糖+IGF-1组的细胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表达显著高于高糖组,与正常组无显著差异。5.高糖抑制THCE细胞迁移能力,下调迁移相关因子MMP-2mRNA及蛋白表达。高糖+IGF-1组的细胞迁移能力、MMP-2mRNA及蛋白表达显著高于高糖组,与正常组无显著差异。6.高糖诱导THCE细胞凋亡,上调促凋亡因子bax mRNA及蛋白表达,下调凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表达。添加IGF-1可改善高糖诱导的细胞凋亡及bax、bcl-2表达变化,但与正常组相比,仍存在显著差异。结论：在THCE细胞及糖尿病大鼠角膜上皮中,高糖抑制创伤刺激的IGF-1及IGF-1R表达。高糖通过抑制IGF-1表达,引起ki-67、MMP-2、bcl-2表达下调、bax表达上调,从而降低THCE细胞增殖、迁移,诱导THCE细胞凋亡,这可能是导致角膜上皮细胞创伤愈合延迟的原因之一。第二部分：β-catenin信号在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用研究目的：研究高糖培养的THCE划伤后β-catenin信号的表达,探讨激活β-catenin信号对高糖培养的THCE细胞增殖、迁移、凋亡的影响及相关分子机制,阐明β-catenin信号在高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合中的作用。方法：1.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加β-catenin信号激活剂Licl(0.5mM)。对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞,进行划伤刺激,于不同时间点利用real-time PCR法检测P-catenin、 cyclinD1、c-myc mRNA表达,western blot分析β-catenin、cyclin D1、c-Myc蛋白表达。2.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加0.5mM Licl。于刺激后不同时间点分别对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞,利用MTT法检测细胞增殖能力；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；Annexin V-FITC/PI双荧光染色法+流式细胞仪检测细胞凋亡。3.高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加0.5mM Licl。于刺激后不同时间点分别收集5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+Licl处理的三组细胞,利用real-time PCR法、western blot及免疫荧光细胞化学法检测增殖、迁移及凋亡相关因子ki-67、MMP-2、bax、bcl-2mRNA及蛋白的表达。结果：1.高糖抑制P-catenin cyclin D1、c-Myc mRNA及蛋白表达,外源性添加Licl可上调P-catenin、cyclin D1、c-Myc mRNA及蛋白表达,激活P-catenin信号。2.高糖抑制THCE细胞存活率,下调增殖相关因子ki-67mRNA及蛋白表达。高糖+Licl组的细胞存活率、ki-67mRNA及蛋白表达显著高于高糖组,与正常组无显著差异。3.高糖抑制THCE细胞迁移能力,下调迁移相关因子MMP-2mRNA及蛋白表达。高糖+Licl组的细胞迁移能力、MMP-2mRNA及蛋白表达显著高于高糖组,但与正常组相比,仍存在差异。4.高糖诱导THCE细胞凋亡,上调促凋亡因子bax mRNA及蛋白表达,下调凋亡抑制因子bcl-2mRNA及蛋白表达。添加Lic1可改善高糖诱导的细胞凋亡及bax、bcl-2表达变化,但与正常组相比,存在显著差异。结论：在THCE细胞中,高糖通过抑制β-catenin及下游靶基因cyclin D1、c-Myc的表达,引起ki-67、MMP-2、bcl-2表达下调、bax表达上调,从而降低THCE细胞增殖、迁移,诱导THCE细胞凋亡,这可能是导致角膜上皮细胞创伤愈合延迟的原因之一。第三部分：IGF-1调控β-catenin信号参与高糖培养的角膜上皮细胞创伤愈合的研究目的：研究高糖培养的THCE划伤后,外源性IGF-1对P-catenin信号表达的影响,明确IGF-1是否通过调控β-catenin信号共同参与高糖损害的角膜上皮细胞创伤愈合。方法：高糖预处理THCE细胞且生长因子饥饿后,外源性添加IGF-1。对5mM葡萄糖、25mM葡萄糖、25mM葡萄糖+IGF-1处理的三组细胞,进行划伤刺激,于不同时间点利用real-time PCR法检测P-catenin cyclin D1mRNA表达,western blot分析β-catenin、cyclin D1蛋白表达。结果：高糖抑制β-catenin、cyclin D1mRNA及蛋白表达,外源性添加IGF-1可显著上调高糖抑制的β-catenin、cyclin D1mRNA及蛋白表达。结论：IGF-1可调控β-catenin信号共同参与糖尿病角膜上皮创伤愈合。