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研究背景：免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia, ITP)是一种免疫介导的血小板破坏过多和生成减少而引起的自身免疫性疾病。尽管B细胞介导的抗血小板自身抗体的产生在其中发挥重要作用,但ITP的精确发病机制尚未完全阐明。目前普遍认为,T细胞免疫功能紊乱促进了ITP的发展,其中辅助性T细胞(Th)及其细胞因子在ITP的发病机制中的作用日益受到重视。Th17及Treg细胞是近年来较新发现的CD4+T细胞亚群,其分化与功能不同于Th1细胞及Th2细胞。Th17/Treg平衡控制着自身免疫反应,在调节T细胞功能上起关键作用,其失衡会导致自身免疫性疾病。目前研究显示,Th17/Treg失衡可能促进ITP的发展。Notch信号在各种细胞功能上起关键作用,包括细胞增殖、分化和凋亡等。然而,Notch信号在ITP患者Th17/Treg失衡中的确切机制尚未见报道。研究目的：本研究旨在进一步验证ITP患者中存在Th17/Treg失衡,探讨Notch信号在ITP患者Th17/Treg失衡中的作用及机制,进一步阐明ITP的发病机制,并可能为ITP的治疗提供新的靶点。研究方法：选取2011年3月至2012年5月山东大学齐鲁医院收治的新诊断的ITP患者及健康志愿者为研究对象,收集外周静脉血。采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,实验组分别用不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT处理,对照组用等体积的DMSO处理,在IL-2维持下,在37℃、5%CO2孵箱中培养72h。收集细胞,采用流式细胞术检测Th17细胞、Treg细胞及Th17/Treg比值在各组中的表达情况,实时定量PCR技术检测Notch信号分子(Notch1、Hesl和Hey1)及Th17和Treg细胞特异性转录因子(RORyt和Foxp3)的mRNA表达情况,用CCK-8和凋亡试剂盒检测各组细胞增殖和凋亡的变化；收集上清,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测IL-17. IL-21及IL-10在各组中的水平。结果：1. DAPT抑制Notch信号：经过不同浓度DAPT处理之后,Notch1在ITP患者及正常健康人中的表达呈现降低趋势,但未达到统计学差异(p＞0.05)。与DMSO组相比,Hes1和Hey1在ITP患者各实验组中的mRNA表达水平降低,且在5μmol/L DAPT、lOμmol/LDAPT和20μmol/L DAPT组中具有统计学意义(p＜0.05)。与DMSO组相比,Hes1和Hey1在正常健康人各实验组中的mRNA表达水平降低,但未达到统计学差异(p＞0.05)。2. DAPT抑制Notch信号下调ITP患者升高的Th17细胞及Th17/Treg比值：2.1与正常健康人相比,Th17细胞在ITP患者中的水平明显升高,Treg细胞的表达水平显著降低,Th17/Treg的比值显著升高(p＜0.05)2.2与DMSO组相比,ITP患者各实验组中Th17细胞及Th17/Treg比值明显下降,而且这种下降具有剂量依赖性,在20μmol/L DAPT作用下降到最低(p＜0.05)；ITP患者各实验组中Treg细胞有轻微升高趋势,但未达到统计学差异(p＞0.05)3. DAPT抑制Notch信号对ITP患者Th17/Treg相关细胞因子分泌的影响：与DMSO组相比,ITP患者各实验组中IL-17的水平明显降低,而且这种下降具有剂量依赖性,在20μmol/L DAPT作用下降到最低(p＜0.05)。与DMSO组相比,IL-21和IL-10在ITP患者实验组中的水平未见明显变化(p＞0.05)。4. DAPT抑制Notch信号后RORyt和Foxp3mRNA表达的检测：4.1与正常健康人相比,RORyt在ITP患者中的mRNA表达水平明显升高,Foxp3在ITP患者中的mRNA表达水平显著降低,RORyt/Foxp3比值在ITP患者中显著升高(p＜0.05)。4.2与DMSO组相比,RORyt在ITP患者各实验组中的mRNA表达水平明显降低(p＜0.05),而且这种下降具有剂量依赖性,在20μmol/L DAPT组中下降到最低(p＜0.05)。Foxp3在ITP患者各实验组中的mRNA表达虽有升高趋势,但未达到统计学差异(p＞0.05)。RORγt/Foxp3比值在ITP患者各实验组中的水平虽表现出降低的趋势,但不具有统计学意义(p＞0.05)。5. DAPT抑制Notch信号促进细胞凋亡：在ITP患者中,与DMSO组相比,10μmol/L DAPT组与20μmol/L DAPT组中细胞凋亡率明显升高(p＜0.05)；在正常健康人中,20μmol/L DAPT组中细胞凋亡率明显高于DMSO组(p＜0.05)20μmol/L DAPT组细胞凋亡率明显高于2.5μmol/L DAPT组和5μmol/L DAPT组(p＜0.05)。6. DAPT抑制Notch信号对细胞增殖的影响：在ITP患者中,与DMSO组相比,各实验组中细胞增殖未见明显变化(p＞0.05)。在正常健康人中,DAPT对细胞增殖也无明显影响(p＞0.05)。结论：1.在ITP患者中存在Th17及其转录因子RORγt升高、Treg细胞及其转录因子Foxp3降低、以及Th17/Treg和RORγt/Foxp3比值的升高,推测Th17/Treg失衡在ITP的发病中具有重要的作用；2.抑制Notch信号通路,可显著降低ITP患者中Th17细胞、轻微升高Treg细胞、纠正Th17/Treg比值失衡；3.抑制Notch信号通路,可降低ITP患者中Th17细胞因子IL-17及其转录因子RORγt, Treg相关细胞因子IL-10及转录因子Foxp3变化未达统计学意义；4.抑制Notch信号通路,能够诱导ITP患者外周血单个核细胞凋亡；5. DAPT阻断Notch信号活性,通过下调RORγt转录因子的mRNA表达来逆转ITP患者Th17细胞的升高及Th17/Treg失衡。应用γ-分泌酶抑制剂调整Th17/Treg平衡网络可能是ITP未来治疗的新靶点。