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昆虫中肠存在半渗透性的围食膜,它有利于食物的消化,保护中肠免受机械损伤以及抵御病原微生物的入侵,是害虫防治的潜在作用靶标。围食膜由蛋白质、几丁质和蛋白聚糖组成。其中几丁质结合蛋白(Chitin binding protein,CBP)是构成围食膜的主要结构蛋白之一。此外,几丁质结合蛋白也是昆虫表皮、翅、触角、口器等骨化组织的重要组分。 斜纹夜蛾六龄幼虫期围食膜结构完整,进入预蛹期和蛹期后围食膜逐渐解体。这一外在现象与斜纹夜蛾几丁质结合蛋白基因在中肠EST文库中的表达丰度相一致,即六龄幼虫期表达量最高,预蛹期没有检测到表达。这暗示几丁质结合蛋白与昆虫中肠的变态发育过程密切相关。 为进一步揭示几丁质结合蛋白与昆虫变态发育的关系,表达调控的机制以及其功能,我们从斜纹夜蛾中肠EST库中鉴定了一种几丁质结合蛋白基因Slcbp,克隆了其全长cDNA,对其序列特征进行了生物信息学分析;同时,我们采用半定量PCR和定量PCR技术检测了其在不同发育时期,不同组织的时空特异性表达,以及对饥饿和两种生长激素(JH和20E)诱导的响应情况;克隆了其5’UTR序列,分析了可能的转录因子结合位点;此外,我们还采用原核表达系统表达并纯化了该蛋白,检测了其与几丁质的离体结合情况。我们的实验结果表明: (1)Slcbp基因ORF全长1020bp,编码339个氨基酸,其中N端的前17个氨基酸为信号肽。通过NCBI在线BLAST分析,Slcbp与甜菜夜蛾几丁质结合蛋白的相似性高达99%,具有四个几丁质结合结构域。 (2)时空特异性表达分析表明:Slcbp基因在中肠专一表达,而在脂肪体、表皮、马氏管、血淋巴中检测不到。Slcbp只在幼虫期高表达,而在卵、预蛹、蛹、成虫期检测不到。这说明,Slcbp是幼虫中肠特异性表达的基因。 (3)饥饿显著诱导Slcbp的上调表达,而两种激素(JH和20E)对该基因的表达具有显著的抑制作用。 (4)5’UTR分析表明,该基因起始密码子附近存在一段451bp的内含子;另外,在其5’UTR区域鉴定出了多种与发育调控相关的转录因子结合位点。 (5)原核表达并纯化的SLCBP蛋白与几丁质可以发生特异性体外结合,这与其具有4个几丁质结合结构域相一致。 通过以上分析,我们认为Slcbp是一个在幼虫期中肠专一性表达的几丁质结合蛋白基因。根据这一特性,我们认为它很可能是一种围食膜蛋白基因,有助于维持昆虫围食膜结构的完整性。Slcbp受到食物因素和两种激素(JH和20E)的共同调控。这些转录因子是否参与Slcbp的调控需要进一步深入研究。 本研究对揭示昆虫几丁质结合蛋白基因的功能以及其表达调控的机制,对阐明昆虫围食膜在变态发育期变化的分子机理具有重要意义。该机理的研究还有助于鉴定和发现新的害虫防治靶标,有利于害虫的可持续治理。