【摘 要】
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第一部分:奥美拉唑对万古霉素所致HK-2细胞毒性的保护作用目的:考察万古霉素单用与联用奥美拉唑后对HK-2细胞存活率及细胞形态的影响。方法:将正常HK-2细胞分为对照组、万古霉素组、万古霉素与奥美拉唑联合用药组。对照组加入完全培养基,万古霉素组加入含万古霉素的完全培养基,联合用药组用含奥美拉唑的培养基与含万古霉素的培养基先后干预。采用CCK8法检测万古霉素单用与联用奥美拉唑后对HK-2细胞存活率的
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第一部分:奥美拉唑对万古霉素所致HK-2细胞毒性的保护作用目的:考察万古霉素单用与联用奥美拉唑后对HK-2细胞存活率及细胞形态的影响。方法:将正常HK-2细胞分为对照组、万古霉素组、万古霉素与奥美拉唑联合用药组。对照组加入完全培养基,万古霉素组加入含万古霉素的完全培养基,联合用药组用含奥美拉唑的培养基与含万古霉素的培养基先后干预。采用CCK8法检测万古霉素单用与联用奥美拉唑后对HK-2细胞存活率的影响;荧光倒置显微镜观察各组细胞形态的差异。结果:万古霉素在1～20 mg·m L-1浓度范围内,对HK-2细胞的毒性作用呈浓度依赖性增强;与单独应用万古霉素相比,联用奥美拉唑后HK-2细胞存活率增加（P＜0.05）,形态学与对照组相近。结论:万古霉素对HK-2细胞具有毒性作用,联用奥美拉唑后可使万古霉素对HK-2细胞毒性作用降低。第二部分:奥美拉唑对HK-2细胞中万古霉素浓度的影响目的:建立测定HK-2细胞内液和外液中万古霉素浓度的HPLC法,探究联用奥美拉唑后HK-2细胞内液和外液中万古霉素浓度的变化。方法:HPLC分析色谱条件:色谱柱为Diamonsil C18柱（150 mm×4.6mm,5μm）;流动相为甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液（p H3）（17:83,V/V）;流速1.0 m L·min-1;柱温30℃;检测波长236 nm;进样量20μL。对HPLC的专属性、精密度、回收率、稳定性等进行方法学验证。将HK-2细胞分为万古霉素单用及联用奥美拉唑干预两组,分别收集药物干预后的细胞内液和细胞外液,对其中的万古霉素浓度进行HPLC定量分析。结果:在选定色谱条件下,万古霉素的保留时间为17.1 min;细胞内液中万古霉素浓度的标准曲线方程为Y=6.04 X-0.0008（R~2=0.9973）;细胞外液中万古霉素浓度的标准曲线方程为Y=4.31 X-0.0001（R~2=0.9957）,细胞内液与外液中万古霉素在0.001～8 mg·m L-1浓度范围内线性关系良好;细胞内液中万古霉素的绝对回收率为79.81%～93.97%,相对回收率为84.98%～97.30%;细胞外液中万古浓度的绝对回收率为92.75%～97.78%,相对回收率为85.33%～99.84%;日内、日间精密度的RSD值均小于15%;反复冻融3次、-40℃低温保存3 d的稳定性均良好。联用奥美拉唑5μg·m L-1、50μg·m L-1与100μg·m L-1均可不同程度降低HK-2细胞内万古霉素浓度。结论:建立了HK-2细胞内液和外液中万古霉素的HPLC测定方法,经方法学验证该方法符合万古霉素的分析要求;联用奥美拉唑可降低HK-2细胞内万古霉素浓度。第三部分:万古霉素单用及联用奥美拉唑后HK-2细胞蛋白组表达分析目的:研究万古霉素单用及联用奥美拉唑后对HK-2细胞转运体P-gp和OCT-2蛋白表达的影响。方法:将HK-2细胞分为对照组、万古霉素单用组、万古霉素与奥美拉唑联合用药组,干预后提取各组HK-2细胞总蛋白质,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸（BCA）法测定各组蛋白含量。蛋白通过变性,制胶,电泳,转膜,封闭,一抗、二抗处理后显影,使用Image J测定条带中P-gp和OCT-2蛋白灰度值,观察不同干预条件下HK-2细胞中目的蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,万古霉素单用组中的P-gp及OCT-2表达量均有显著性差异（P＜0.05）,HK-2细胞中P-gp表达随着万古霉素浓度的升高而降低,OCT-2表达随着万古霉素浓度的升高而增加。与万古霉素单用组相比,联用奥美拉唑后P-gp蛋白表达降低,差异有显著性（P＜0.05）;与万古霉素单用组相比,联用奥美拉唑5μg·m L-1组OCT-2蛋白表达无显著差异（P＞0.05）,奥美拉唑50μg·m L-1、100μg·m L-1组有显著性差异（P＜0.05）;奥美拉唑50μg·m L-1组与100μg·m L-1组间的OCT-2蛋白表达水平无显著差异（P＞0.05）。结论:万古霉素可上调HK-2细胞中OCT-2蛋白表达,抑制P-gp蛋白表达,联用奥美拉唑可逆转万古霉素对P-gp与OCT-2影响。
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