气道上皮作为沟通机体内外环境的第一道屏障,除发挥物理性防御作用,更具有丰富的生物学功能,在气道局部微环境稳态维持中发挥重要作用。越来越多研究认识到,气道上皮的结构完整性缺陷或功能紊乱可能是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等气道高反应性疾病的启动环节。哮喘在本质上被公认为慢性炎症性疾病,而Th1/Th2免疫应答失衡学说在哮喘众多发病机制中一直占据主流地位。气道上皮细胞具有抗原呈递细胞的特性,对外表达TOLL样受体(Toll like receptors, TLRs)模式识别捕获外来病原菌,对内通过协同刺激分子B7家族将免疫信号传递给T细胞。这在一定程度上影响T细胞免疫平衡和气道局部的免疫状态。整合素β4(integrin β4)作为形成半桥粒结构的中心组份,介导气道上皮细胞与基底膜的牢固粘附,其正常表达是维持气道上皮细胞“锚着依赖性”生长的重要基础。哮喘患者气道粘膜镜检常有上皮脱落、凋亡。本课题组前期工作已经证实哮喘病人外周血和气道粘膜integrin β4的表达均低于健康人群,且integrin (34在气道上皮细胞具有促增殖、抑凋亡、抗氧化损伤、减少免疫原卵白蛋白(ovalbumin, OVA)摄取等保护性作用。据此我们假设：integrin β4表达缺陷可能是引起气道上皮结构和功能失稳态进而提高哮喘易感性最终导致发病的关键因素。那么,integrin β4是否也能影响气道上皮细胞本身免疫状态从而调节气道局部的免疫应答?本研究拟合成integrin β4的特异性小干扰RNA (siRNA)片段,在人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)中沉默integrin β4基因表达,观察其对人支气管上皮细胞B7分子家族谱、抗原OVA摄取后TLR4的表达的改变,以及对共培养的人淋巴细胞增殖的影响。以拓宽对integrin β4生理功能的认识,进一步阐明哮喘发病机制。第一部分合成特异性integrin β4siRNA并瞬时转染至HBECs目的：利用siRNA技术抑制integrin β4在HBECs中的表达方法：化学合成integrin β4siRNA片段,经脂质体转染人支气管上皮细胞株,采用real-time PCR和Western-blotting验证沉默效率。结果：real-time PCR和Western-blotting结果显示,siRNA片段转染后气道上皮integrin β4表达显著下降。结论：筛选的integrin β4siRNA片段可高效沉默人支气管上皮细胞株integrin β4基因表达。第二部分Integrin β4基因沉默对支气管上皮细胞B7H1及B7DC表达的影响目的：观察integrin β4基因沉默后HBECs共刺激分子B7家族B7H1和B7DC的改变。方法：运用real-time PCR和流式细胞术检测integrin β4沉默组和对照组B7H1和B7DC的mRNA水平及蛋白水平的改变。结果:real-time PCR结果显示,B7H1和B7DC mRNA在integrin β4沉默后表达明显上调,流式细胞术在蛋白水平的检测也表现出一致的趋势。结论：integrin β4沉默促进入支气管上皮细胞株B7H1、B7DC的表达。第三部分Integrin P4基因沉默对人支气管上皮细胞TLR4基因表达的影响目的：观察siRNA靶向沉默integrin β4对人支气管上皮细胞TLR4基因表达的影响。方法：免疫细胞化学技术(ICC)观察integrin β4沉默的HBECs经OVA刺激后TLR4基因表达的改变。结果：siRNA转染48h可显著抑制HBECs中integrin β4的蛋白表达；与对照组相比,经siRNA转染的人支气管上皮细胞株在OVA刺激1h后,TLR4表达明显上调。结论：siRNA可高效沉默人支气管上皮细胞株integrin β4,显著上调OVA刺激后TLR4的表达。第四部分Integrin β4基因沉默对与HBECs共培养的淋巴细胞增殖的作用目的：观察integrin β4基因沉默是否影响与HBECs共培养的淋巴细胞的增殖。方法：建立integrin P4基因沉默的HBECs与新鲜人血分离的淋巴细胞共培养体系,MTT法检测淋巴细胞增殖。结果：OVA刺激促进与HBECs共培养的淋巴细胞增殖, integrin β4siRNA可在一定程度上抑制这种增殖效应。结论：人支气管上皮细胞integrin β4沉默抑制OVA对共培养的淋巴细胞的增殖作用。