背景研究表明,在急性心肌缺血恢复血流灌注后,由缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)所致的心肌梗死后死亡率仍然高达10%。动物实验亦发现,心肌缺血时高达50%的最终心肌梗死面积是归因于IRI。目前,已经公认缺血预处理是最为强大的内源性心肌保护干预措施。然而,由于心肌缺血事件的不可预测性,所以在临床实践中很难对其采取预先干预措施。因此,除了能够在实施心脏手术的患者选择性应用之外,缺血预处理的临床应用价值十分有限。缺血后处理则解决了临床干预时机选择的问题,而且其也已被证明具有确切的心肌保护作用。但是,诸如反复阻塞冠状动脉这样的操作有导致病变冠状动脉破裂或粥样斑块脱落等并发症的高度风险,故其临床应用价值也十分有限。相比之下,肢体远隔缺血后处理则能够避免在心脏直接进行操作,而且大量研究表明其对心肌IRI具有明确的保护作用。此外,肢体远隔缺血后处理还具有安全、实施简单和费用低廉等优点。因此,肢体远隔缺血后处理不失为临床治疗心肌IRI的一种较佳选择。现已明确,炎症反应在心肌IRI的发生和发展过程中发挥着极为重要的致病作用,并且调节炎症反应可以减轻心肌IRI。晚近研究发现,迷走神经同样具有免疫炎症调节功能,其激活后能够通过胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)而实现对炎症反应的调控。在内毒素血症、结肠炎、风湿性关节炎和IRI等炎症性疾病时,迷走神经刺激能够通过抑制炎症细胞募集和炎症细胞因子释放而调控炎症反应,进而发挥其保护作用。虽然已经证实迷走神经刺激能够减小IRI所致的心肌梗死面积,但是目前尚无研究系统观察迷走神经刺激后处理对心肌缺血-再灌注损伤时心肌局部与全身炎症反应的影响。联合应用不同的干预措施以获得有益的强效心肌保护效果一直是心肌IRI保护研究领域的重要方向,而且迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理是两种作用机制明显不同的心肌保护干预措施。因此,我们设计了这个随机对照实验,主要目的包括：①观察迷走神经刺激后处理对心肌IRI保护的有效性、可用性和最佳干预时间；②评价将迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理这两种极具临床应用前景的简单干预措施联合应用能否获得有益的协同性心肌保护作用；③观察PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在迷走神经刺激后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用中的地位,以探索不同心肌保护干预措施的内在作用机制。本实验分为三个部分：第1部分：迷走神经刺激后处理对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其最佳干预时间的研究第1部分实验的目的是采用大鼠在体心肌IRI模型比较性观察在不同时间点应用迷走神经刺激后处理对心肌IRI及其炎症反应的影响,以确定迷走神经刺激后处理的心肌保护作用及其最佳干预时间。将140只体重290～320g的成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠麻醉后随机平均分为七组(每组20只)：空白对照组(S组)；对照组(C组)；缺血预处理组(IPC组)；心肌缺血15min迷走神经刺激后处理组(POESI15组)；再灌注前迷走神经刺激后处理组(POESRO组)；再灌注30min迷走神经刺激后处理组处理组(POESR30组)；再灌注60min迷走神经刺激后处理组(POESR60组)。所有大鼠开胸后采用丝线将其冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery, LAD)套扎做成活结。除S组之外,所用大鼠均接受局部心肌缺血30min(阻断LAD)和再灌注120min(开放LAD)的处理。C组不采用任何其他干预措施；IPC组在结扎LAD前进行3个循环的缺血预处理,每个循环是由5min的LAD阻断和5min的LAD开放组成,总处理时间是30min; POESI15、POESR0、POESR30和POESR60组是分别在心肌缺血15min时、心肌再灌注前即刻、心肌再灌注30min时和心肌再灌注60min时对大鼠的右侧迷走神经进行电刺激,持续时间为30min。实验过程中,连续监测心率(heart rate, HR)、平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)和Ⅱ导联心电图(electrocardiogram, ECG),并保持大鼠直肠温度在36.5～37.5℃之间。然后,将每组大鼠进一步随机平均分为2个亚组(每亚组10只),第1亚组在再灌注30min、60min和120min时抽取血液标本,采用大鼠专用试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白I (cardiac troponin-I, cTnI)、肌酸激酶心肌型同工酶(myocardial-bound creatine kinase, CK-MB)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、高迁移率组蛋白1(high mobility group box1protein, HMGB1)、细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule1, ICAM1)、白介素-1(interleukin-1, IL-1)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和白介素-10(interleukin-10, IL-10)的浓度；在实验结束时,采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色技术检测心肌梗死面积(infarct size, IS%)。在实验结束时,第2亚组用于检测缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6和IL-10的含量。结果显示,各组大鼠的一般情况和心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异无显著统计学意义。与S组、C组或IPC组相比,POESI15组的HR在缺血期和再灌注期间均明显降低,POESRO组、POESR30组和POESR60组的HR在再灌注期间明显降低。与S组相比,C组、IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组在缺血期和再灌注期的MAP和心率血压乘积(rate-pressure product, RPP)均明显降低。与IPC组相比,C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血期发生室性心律失常的大鼠数目明显增多,而且缺血期室性心律失常评分亦明显增高。与C组相比,IPC组、POESI15组和POESRO组再灌注初期发生室性心动过速(ventricular tachycardia, VT)的大鼠数目明显减少,而且再灌注初期室性心律失常评分亦明显降低。与C组相比,IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低；与IPC组相比,POESI15组、POESRO组.POESR30组和POESR60组的IS%值均明显增高；与POESI15组相比,POESR60组的IS%值、血清cTnI、CK-MB浓度明显增高,POESRO组和POESR30组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度无显著统计学差异；与POESRO组相比,POESR60组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度明显增高,POESR30组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度无显著统计学差异；与POESR30组相比,POESR60组的IS%值、血清CK-MB浓度无显著统计学差异。与S组相比,C组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度明显增高；C组、IPC组和POESI15组再灌注60min时血清HMGB1浓度,C组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1浓度明显增高；C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高；C组、IPC组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清IL-1的浓度明显增高；C组、IPC组、POESR30组和POESR60组再灌注120mmin时血清IL-6浓度明显增高；POESI15组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与C组相比,IPC组和POESI15组再灌注30min和60min时血清TNF-a浓度明显降低；IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6浓度明显降低。与IPC组相比,POESI15组再灌注60mmin时血清TNF-a浓度明显增高；POESR60组再灌注120min时血清TNF-a浓度明显增高；POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1浓度明显增高;POESI15组再灌注120mmin时血清IL-1的浓度明显降低；POESI15组和POESRO组再灌注120min时血清IL-6浓度明显降低。与POESI15组相比,POESRO组、POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1的浓度明显增高；POESR60组再灌注120min时血清IL-1、IL-6和TNF-a的浓度明显增高。与POESRO组相比,POESR60组再灌注120min时血清HMGB1、IL-6和TNF-a的浓度明显增同；POESR30组和POESR60组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高。与POESR30组相比,POESR60组再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1和TNF-α浓度明显增高。与S组相比,C组缺血区心肌组织TNF-α和HMGB1含量明显增高,IPC组缺血区心肌组织TNF-α含量明显降低；C组和POESR60组非缺血区心肌组织TNF-a含量明显增高；C组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显增高,IPC组、POESI15组、POESRO组和POESR30组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；C组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量明显增高；C组和POESR60组非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量明显增高,IPC组、POESI15组和POESRO组非缺血区心肌组织ICAM1含量明显降低；C组、IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组非缺血区心肌组织IL-1含量、缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；IPC组和POESI15组非缺血区心肌组织IL-6含量明显降低。与C组相比,IPC组、POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、IL-1和IL-6含量明显降低；POESI15组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。与IPC组相比,POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织TNF-a含量明显增高；POESI15组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低,POESR60组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显增高；POESI15组、POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高；POESR30组和POESR60组非缺血区心肌组织ICAM1、缺血区IL-6含量明显增高；POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-1、非缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与POESI15组相比,POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-a含量、非缺血区心肌组织ICAM1含量、缺血区心肌组织IL-1含量明显增高；POESR60组缺血区心肌组织HMGB1、IL-6含量明显增高,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显降低；POESRO组、POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织ICAM1含量、非缺血区心肌组织HMGB1、IL-1和IL-6含量明显增高。与POESRO组相比,POESR60组缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、IL-1、IL-6含量、非缺血区心肌组织HMGB1、IL-1和IL-6含量明显增高；POESR30组和POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高。与POESR30组相比,POESR60组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量以及非缺血区心肌组织HMGB1含量均明显增高。第2部分：联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理对心肌缺血-再灌注损伤保护作用的研究根据第1部分实验的结果,在确定迷走神经刺激后处理最佳干预时间的基础上我们设计了这部分实验,其目的是评价联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理能否获得增强的心肌保护作用。将120只体重290-320g的成年雄性SD大鼠麻醉后随机平均分为六组(每组20只)：空白对照组(S组)；对照组(C组)；缺血预处理组(IPC组)；迷走神经刺激后处理组(POES组)；肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)；联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理组(POES-LRIPOC组)。C组和IPC组的处理同第1部分实验；POES组是根据第1部分实验获得的结果在最佳时间点进行迷走神经刺激；LRIPOC组的基本处理与C组相同,在心肌缺血20min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成双后肢缺血10mmin,并在开放LAD实施心肌血流再灌注的同时开放后肢血流灌注；POES-LRIPOC组的基本处理与C组相同,迷走神经刺激后处理的实施方法同POES组,肢体远隔缺血后处理的实施方法同LRIPOC组。然后,将每组大鼠进一步随机平均分为2个亚组(每亚组10只),各组检测项目与第1部分实验相同。结果显示,各组大鼠的一般情况和心肌缺血前血流动力学参数的基础值比较差异无显著统计学意义。与S组、C组或IPC组相比,POES组和POES-LRIPOC组的HR在缺血期和再灌注期明显降低。与S组相比,C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的MAP和RPP在缺血期和再灌注期均明显降低。与IPC组相比,C组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血期室性心律失常发生率和室性心律失常评分明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注期室性心律失常发生率和室性心律失常评分均明显降低；与LRIPOC组相比,IPC组、POES组和POES-LRIPOC组再灌注期间室性心律失常发生率和室性心律失常评分明显降低。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的IS%值、血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低；与IPC组或POES-LRIPOC组相比,POES组和LRIPOC组的IS%值明显增高；与POES组相比,LRIPOC组的IS%值和血清cTnl浓度明显增高,LRIPOC组的血清CK-MB浓度明显降低。与LRIPOC组相比,IPC组和POES-LRIPOC组的血清cTnI和CK-MB浓度均明显降低。与S组相比,C组和LRIPOC组再灌注30min时血清TNF-a浓度明显增高；C组再灌注60min和120min时血清TNF-a浓度明显增高,IPC组和POES-LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度明显降低；IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清TNF-a浓度明显降低；C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注60min时血清HMGB1浓度明显增高；C组和LRIPOC组再灌注120min时血清HMGB1浓度明显增高；C组、POES组和LRIPOC组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显增高；C组、IPC组和LRIPOC组再灌注120min时血清IL-1和IL-6浓度明显增高；POES组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1、IL-6浓度明显降低；IPC组再灌注60min时血清HMGB1浓度明显降低；POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-10浓度明显增高。与IPC组相比,POES组和LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度明显增高；LRIPOC组再灌注120min时血清HMGB1和ICAM1浓度明显增高；POES组和POES-LRIPOC组再灌注120min时血清IL-1和IL-6浓度明显降低。与POES组相比,LRIPOC组再灌注60min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6浓度明显增高；POES-LRIPOC组再灌注120min时血清ICAM1浓度明显降低。与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组再灌注30min、60min和120min时血清TNF-a浓度、再灌注120min时血清HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6浓度均明显降低。与S组相比,C组缺血区心肌组织TNF-a和HMGB1含量以及非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1和ICAM1含量明显增高；IPC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-a含量明显降低；IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；C组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织ICAM1含量明显增高；IPC组、POES组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织ICAM1和IL-6含量明显降低；C组、POES组和LRIPOC组缺血区心肌组织IL-1和IL-6含量明显增高；C组、IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织IL-1、IL-10含量、缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；C组和LRIPOC组非缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与C组相比,IPC组、POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织TNF-α、HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量均明显降低；POES组和POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。与IPC组相比,POES组和LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1和IL-1含量明显增高；POES-LRIPOC组缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；POES组和POES-LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1含量明显降低；LRIPOC组非缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量,缺血区心肌组织IL-6含量明显增高。与POES组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1和IL-1含量明显降低,非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高；LRIPOC组非缺血区心肌组织HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量以及缺血区心肌组织ICAM1、IL-1和IL-6含量明显增高,缺血区心肌组织IL-10含量明显降低。与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织TNF-α、ICAM1、IL-1和IL-6含量以及非缺血区心肌组织HMGB1、ICAM1、IL-1和IL-6含量明显降低,缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织IL-10含量明显增高。第3部分:PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在迷走神经刺激后处理以及联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用机制中地位的研究本部分实验的目的是探讨PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路在单独应用迷走神经刺激后处理以及联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理心肌保护作用机制中的地位。将20只体重290-320g的成年雄性SD大鼠麻醉后随机平均分为四组(每组5只)：对照组(C组)；迷走神经刺激后处理组(POES组)；肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)；联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理组(POES-LRIPOC组)。各组的处理基本同本实验第二部分,但是在开放LAD实施再灌注60min时结束实验,分别取大鼠左心室缺血区心肌标本和右心室非缺血区心肌标本。从缺血与非缺血区心肌标本中提取总蛋白和总RNA,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)技术观察Akt和STAT3基因mRNA在缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织的表达情况,并通过免疫蛋白印迹分析(Western-blotting)技术观察缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt和STAT3蛋白磷酸化的情况。RQ-PCR结果显示,与C组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达均明显增强；与POES组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达明显增强；与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织Akt基因和STAT3基因mRNA表达明显增强。Western-blotting结果显示,与C组相比,POES组、LRIPOC组和POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加；与POES组相比,POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加；与LRIPOC组相比,POES-LRIPOC组的缺血区心肌组织和非缺血区心肌组织p-Akt蛋白和p-STAT3蛋白的灰度值明显增加。结论通过本实验,我们得出以下结论：1.心肌缺血15min时、再灌注前即刻、再灌注30mmin和再灌注60min时实施迷走神经刺激后处理均能够明显减小IRI所致的心肌梗死面积,并明显降低血清cTnI和CK-MB浓度,其中以在再灌注60min实施迷走神经刺激后处理的心肌保护效果最差,以在心肌缺血15mmin时实施迷走神经刺激后处理的心肌保护效果最强,但是迷走神经刺激后处理的心肌保护作用弱于缺血预处理。2.缺血预处理、缺血期和再灌注期不同时间点进行迷走神经刺激后处理均能明显抑制再灌注期室性心律失常的发生；缺血15min时实施迷走神经刺激后处理抑制再灌注期心律失常的作用较其他时间点进行迷走神经刺激后处理更强。3.联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理能够获得更强的心肌保护作用,并且该心肌保护作用与缺血预处理的心肌保护作用几无差异。4.缺血预处理、缺血期和再灌注期不同时间点进行迷走神经刺激后处理、肢体远隔缺血后处理、联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理均能通过抑制心肌IRI过程中的炎症反应而发挥心肌保护作用。5. PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路相关基因在转录后蛋白磷酸化水平的上调参与了迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护作用；而PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路相关基因mRNA水平的上调则参与了联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护。同时,联合应用迷走神经刺激后处理和肢体远隔缺血后处理的心肌保护作用机制可能还涉及了PI3K/Akt和JAK/STAT信号转导通路蛋白磷酸化水平的上调。