茶因其独特的味道、香气和健康功效而得到全世界广大消费者的喜爱。决定茶品质的风味物质主要为儿茶素、茶氨酸和咖啡碱等滋味物质,以及萜烯类等香气物质。这些风味物质的生物合成受到季节气候和叶片发育阶段等因素的影响,其内在分子调控机制较为复杂。越来越多的研究发现,miRNA作为基因转录后的关键调控因子,对植物次生代谢的调控具有重要影响,并正成为研究热点,然而目前对其参与茶叶风味物质合成的调控机制却知之甚少。因此本研究基于多组学（转录组、代谢组、降解组和sRNA测序）,以不同月份（四月、六月、八月、九月、十月）和不同发育阶段（芽、一叶、二叶、三叶、四叶）的茶树鲜叶为材料,比较分析了茶树叶片中miRNA的时空表达特征以及其靶基因的调控功能,并通过加权共表达网络分析和相关的实验验证,以期揭示miRNA在茶叶主要风味物质合成中的调控机理,为深入理解茶叶风味物质形成与调控机制提供新视野。主要的研究结果如下:1.miRNA及其靶基因的鉴定和差异分析根据sRNA测序结果,共获得了 857条成熟的miRNA,其中保守的miRNA 481条,分属于85个家族,且成员最多的家族为miR166（31个）、miR171（27个）和miR169（26个）,在其它植物中未曾被报道的有376条;比较分析发现,不同月份间差异表达的miRNA有200条,不同叶位间有228条;不同月份间差异miRNA和不同叶位间共同拥有的仅85条。结合降解组数据进一步分析发现,在不同月份有252个miRNA作用的靶基因为646个,不同叶位中有265个miRNA作用的靶基因为702个。整合转录组数据分析表明,不同月份间和不同叶位间差异表达的靶基因数量分别为277和242个。通过5’ RLM-RACE对部分靶基因位点进行了验证。2.miRNA靶基因表达模式及功能分析miRNA的靶基因的GO和KEGG功能统计分析显示,不同月份中靶基因多集中在激素响应或激素信号转导等通路,以及次级代谢调控,如萜类化合物、苯丙烷类、类黄酮类物质等。而不同叶位中的靶基因主要分布在激素响应或激素信号转导途径,以及代谢或合成过程。miRNA的差异靶基因的GO和KEGG富集结果显示,不同月份和不同叶位中均在激素响应、信号转导、以及转录相关等通路富集。通过联合分析,在不同月份和不同叶位中分别发现了 70和73对呈负相关的miRNA-靶基因。在不同月份中,表达模式呈负相关性的miRNA-靶基因中,发现多种与次级代谢调控相关的转录因子,如MYB,AP2/ERF、TCP、SPL等;在不同叶位中,负相关表达模式的miRNA-靶基因中,一半以上是与激素响应或生长发育调控相关的转录因子,如GRF、ARF、HD-ZIP;对不同月份和不同叶位中的表达模式呈负相关的miRNA-靶基因进行综合分析发现,只有3对miRNA-靶基因同时处于负相关关系,说明miRNA的转录后调控在时间和空间上存在很大的特异性。此外,成功对12组表达模式呈负相关性的 miRNA-target 进行了 qRT-PCR 验证。3.茶叶风味物质的时空变化对茶叶风味物质在不同叶位进行了测定。对于萜烯类香气物质:芽和一叶中主要积累单萜物质,如芳樟醇、香叶醇、β-月桂烯等;二叶、三叶和四叶主要积累倍半萜物质,如橙花叔醇和紫罗兰酮等。对于滋味物质:在不同叶位中,随着叶位的降低,总儿茶素含量先升高后下降,其中二叶含量最高;非酯型儿茶素和酯型儿茶素的变化趋势恰好相反,前者逐渐升高,后者逐渐降低;咖啡碱含量从芽到一叶时略微升高,然后急剧下降;茶氨酸在芽中的含量要显著高于其他叶位,并且芽中的含量分别是一叶、二叶、三叶和四叶中含量的4.75、4.03、5.67和7.57倍。4.miRNA对风味物质合成的调控基于miRNA、差异表达基因、风味物质进行的WGCNA共表达分析,本研究发现了多种靶向转录因子的miRNA可能参与调控萜烯类、儿茶素、咖啡碱和茶氨酸的合成,如 miR858-MYB、miR3630-bHLH、miR156/miR535-SPL、miR33418/miR156f-ERF、miR160-ARF、miR396-GRF、miR169-NF-YA等。其中:不同月份中,miR169等通过其靶基因NF-YA等参与对茶叶风味物质的调控。而不同叶位中,茶叶风味物质的调控受到miR396及其靶基因GRF等。此外,也发现一些miRNA靶向结构基因参与调控风味物质的合成。随后,对相关的miRNA及其靶基因的表达量进行了 qRT-PCR 和 Northern blot 验证。一方面,结合气象数据分析发现,这些参与调控风味物质合成的miRNA的形成与光照具有很强的相关性,并且其前体的启动子区域序列存在大量光响应元件,提示:不同生长月份的茶叶风味物质含量差异受相关的miRNA调控,而这些miRNA的表达又受到光照的影响。遮阴处理后,与风味物质合成密切相关的6条miRNA表达丰度较对照变化显著,这说明miRNA的表达受到光强的调控。进一步相关性分析发现,光信号通路基因也与miRNA表达量密切相关。至此推测:光通过光信号通路基因在转录水平或转录后水平调控miRNA的生成,进而通过靶基因调控风味物质的合成。另一方面,结合激素数据分析发现,多种激素含量（如IAA、JA、ABA、ZA等）变化与主要风味物质含量变化存在显著性关系,并且这些参与调控风味物质合成的miRNA的表达与激素含量也密切相关。此外许多miRNA的靶基因本身就是激素响应通路的主要参与者或者激素合成调控者,如miR160-miR167-ARF、miR396-GRF、miR164-NAC、miR319-TCP等。因此推测miRNA参与激素信号之间的cross-talk来调控茶叶风味物质的合成。