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目的:内质网是一种重要的细胞器,主要负责膜蛋白、分泌蛋白以及脂类合成、修饰和加工。当内质网中错误折叠蛋白积累,激活内质网应激,导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),从而诱导参与恢复过程中伴侣和蛋白质的表达。内质网应激的诱导可能具有保护作用,但如果持续过度激活而具有细胞毒性,导致细胞死亡。内质网应激参与了多种疾病的发病机制,如肺纤维化、支气管发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)、肺癌等。多种证据表明,内质网应激诱导的细胞功能障碍和细胞死亡是许多疾病的主要致病因素。因此参与内质网应激中的调控因子有可能成为治疗学发现的潜在靶点。内质网应激消减有两种途径:内质网相关蛋白降解(ER-associated protein degradation,ERAD)途径和内质网自噬(ER-phagy)途径。ERAD一种普遍的定义为有缺陷的蛋白质最终被逐出内质网,并通过泛素蛋白酶体系统在细胞质中降解,降解UPR中可溶性的蛋白质。内质网自噬是一种选择性自噬,自噬体中的双膜至少部分来源于内质网,降解内质网中不可溶性蛋白。内质网自噬是一种组成性的或受调控的碎裂作用,将内质网片段运至溶酶体中清除,对细胞内稳态、脂肪平衡和蛋白质平衡的维持有着重要作用。细胞周期进展基因1(cell-cycle progression gene 1,CCPG1)是内质网中驻留蛋白,能够特异性的结合微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)和FIP200蛋白,这些相互作用促进了内质网自噬。UPR能够诱导CCPG1,从而将内质网应激与内质网自噬联系起来,驱动内质网的降解。MLE12细胞系是小鼠II型肺泡上皮细胞近似细胞系,溶酶体源细胞器板层小体是II型肺泡上皮细胞的标志细胞器。我们观察到预先使用奋乃静处理会干扰内体溶酶体功能,增强细胞对抗衣霉素诱发的内质网应激能力,并对奋乃静预处理缓解内质网应激机制以及对MLE12细胞分化状态的影响进行了分析。研究方法:1.Western blot、Real-time PCR和PCR技术分别检测不同浓度的奋乃静预处理MLE12细胞24h,再用衣霉素诱发内质网应激后细胞中Bip蛋白、m RNA和s-XBP1/u-XBP1的表达水平。2.为了检测奋乃静与衣霉素同时处理MLE12细胞对内质网应激的影响,我们采用western blot和Hoechst33342染色法检测奋乃静预处理和非预处理后相应的Bip蛋白和细胞健康状况。3.为了进一步探讨奋乃静对MLE12细胞自噬和溶酶体中胆固醇的影响,我们采用western blot检测不同浓度的奋乃静处理24h和同一浓度处理不同时间后LC3II、P62蛋白的表达水平。Filipin染色检测不同浓度的奋乃静处理24h和同一浓度处理不同时间后溶酶体中胆固醇的聚集情况。4.为了研究奋乃静预处理缓解衣霉素诱发的内质网应激与自噬是否有关,我们采用western blot检测奋乃静分别处理3h、10h,再用衣霉素诱发内质网应激后Bip蛋白的表达水平。我们采用western blot检测不同浓度的奋乃静预处理MLE12细胞24h,再用衣霉素诱发内质网应激后CCPG1蛋白的表达水平。Hoechst33342染色检测3μM奋乃静预处理MLE12细胞24h,再用衣霉素诱发内质网应激的同时加入溶酶体抑制剂Bafilomycin和26S蛋白酶体抑制剂(MG132)后细胞核固缩的情况。5.为了探讨奋乃静处理对MLE12细胞分化的影响,我们采用Real-time PCR检测3μM奋乃静处理MLE12细胞6h、12h、24h、48h后肺泡表面活性蛋白B、C(SPB、SPC)的mRNA的表达水平。结果:1.Western blot和Real-time PCR结果显示,相比未预处理细胞,用3μM的奋乃静预处理后能缓解衣霉素诱发的内质网应激,Bip蛋白和mRNA的表达水平下降,s-XBP1/u-XBP1比例下降,凋亡细胞减少。2.Western blot和Hoechst33342结果显示,奋乃静与衣霉素同时处理不能缓解内质网应激,凋亡细胞增加。3.Western blot和Filipin染色结果显示,与对照组相比,3μM的奋乃静处理8h后LC3II、P62蛋白增加,自噬水平升高,溶酶体中胆固醇显著聚集。说明低剂量奋乃静可使MLE12细胞自噬启动增强,内体溶酶体功能受到影响。4.Western blot检测结果显示奋乃静预处理10h后能缓解内质网应激,而预处理3h无明显变化。Western blot检测结果显示,3μM的奋乃静处理MLE12细胞24h后CCPG1蛋白表达上升。Hoechst33342染色结果显示Bafilomycin抑制剂处理后细胞大量死亡,而MG132抑制剂无明显变化。以上结果表明奋乃静预处理缓解内质网应激可能与内质网自噬途径有关。5.Real-time PCR结果显示,奋乃静预处理MLE12细胞12h后分化标志物SPB的mRNA的表达水平上升、48h后SPC的mRNA的表达水平上升,结果表明奋乃静处理后促进向II型肺泡上皮细胞的分化。结论:低剂量奋乃静预处理增强MLE12细胞自噬水平,提升细胞对抗衣霉素诱发的内质网应激能力,促进其向II型肺泡上皮细胞分化。