墨兰(Cymbidium sinense)是广东省原产的重要花卉,其品种多样,栽培历史悠久,市场前景广阔,但传统的墨兰品种难以实现工厂化繁殖,已不能适应现代兰花产业发展的需求。因此,创建易工厂化繁殖的墨兰资源,培育易产业化的墨兰新品种,解析墨兰组培快繁难的分子机理,对推动墨兰种业和产业发展具有十分重要的现实意义。本文研究了利用有性杂交技术创制易工厂化繁殖墨兰资源的方法;通过对易工厂化繁殖墨兰与传统墨兰的根状茎增殖和分化过程、内源激素和转录组的比较分析,挖掘与墨兰芽分化能力相关的候选基因。主要结果如下:1、墨兰的可交配性与双亲亲缘关系密切相关,品种间的可交配性最高,平均坐果率为70.69%,种间次之,平均坐果率为30.99%,属间最低,平均坐果率仅为4.62%。同一类型的组合中,不同亲本可交配性不同,种间杂交中,墨兰与地生兰、墨兰与杂交兰组合的坐果率较高(61.25%和48.89%),而墨兰与大花蕙兰组合的坐果率较低(4.62%);在40对属间杂交组合中,‘小香’墨兰和‘蝴蝶之吻’(Epilaeliocattleya Butterfly Kisses’Mendenhall’),‘企剑白墨’墨兰和Grammangis ellisii的坐果率分别为50%和83%。墨兰的不可交配性主要表现为花柱不亲和。种子有胚率与双亲亲缘关系有关,品种间和种间组合的有胚率高(87.57%和89.61%),属间组合的有胚率低(38.41%)。果龄和种子起始萌发时间呈显著正相关关系(R=0.7646),果龄为170-190天时,起始萌发时间短,果龄为220天以上时,起始萌发时间长;种子萌发量和亲缘关系有关,品种间组合种子萌发量最高、种间组合次之,属间组合最低。2、对‘玉女兰’ב黄叶红墨’墨兰79个杂交后代的组培快繁特性进行研究,结果发现,其增殖能力表现为强(28%)、较强(25%)、中(25%)、较弱(19%)和弱(3%),芽分化能力表现为强(11%)、较强(20%)、中(38%)、较弱(20%)和弱(9%),生根成苗能力表现为强(3%)、较强(14%)、中(32%)、较弱(30%)和弱(21%)。后代的中间繁殖体类型和试管苗形态亦呈现多样性:中间繁殖体类型有根状茎(47%)、偏根状茎(20%)、中间类型(28%)和偏类原球茎(5%);试管苗形态分大花蕙兰型(33%)、偏大花蕙兰型(24%)、偏国兰型(31%)和国兰型(12%);其中,d26和d521试管苗形态偏向国兰,中间繁殖体为根状茎,绝对增殖率分别为155.9%和126.4%,平均芽分化率分别为618.6%和430.1%,成苗率分别为83.7%和82.0%,均显著高于‘企剑白墨’墨兰。3、‘小凤兰’和‘企剑白墨’墨兰的根状茎结构相似,但根状茎增殖过程中‘小凤兰’的生长速度较‘企剑白墨’快,顶端分生组织不断生长形成新的节,根状茎不断伸长,但较少分支。增殖过程中‘小凤兰’根状茎内生长素含量不断升高,而‘企剑白墨’墨兰的生长素含量不断降低,两品种的细胞分裂素和茉莉酸甲酯的含量在不同增殖阶段也有差异;转录组分析结果表明,‘小凤兰’和‘企剑白墨’墨兰的根状茎在增殖过程中共有9392个差异表达基因,这些差异表达基因在整个增殖过程的表达变化模式各不相同,在‘企剑白墨’墨兰中以下调为主,显著富集到与细胞壁形成、内源刺激响应及碳水化合物代谢有关的代谢通路,在‘小凤兰’中则以上调为主,显著富集到与激素合成、光合作用有关的代谢通路。4、在相同培养基和培养条件下,‘小凤兰’的芽分化进程较‘企剑白墨’墨兰更快,分化出的芽数更多,芽更大。分化过程中,‘小凤兰’根状茎内源生长素含量先迅速升高,再缓慢升高,而在‘企剑白墨’中先轻微降低,再迅速升高,导致细胞分裂素与生长素的比值在‘小凤兰’中基本保持稳定,而在‘企剑白墨’中则先升高再降低。转录组分析结果表明,‘小凤兰’和‘企剑白墨’在根状茎分化过程中共有8625个差异表达基因,它们在整个分化过程的表达变化模式各不相同;两品种中都呈现上调趋势的基因,在‘企剑白墨’富集到与分生组织形成相关,而在‘小凤兰’中则富集到与叶的形成及生长素相关的代谢通路。5、通过定量分析、序列分析和功能分析,筛选出8个芽分化相关的候选基因,其中YUC家族3个、GH3家族2个、CKX家族1个、AHK4类1个和CYP450家族1个。两个GH3类候选基因编码的蛋白都具有IAA-Amido合成酶的催化活性;YUC蛋白功能抑制剂Yucasin能够抑制‘小凤兰’的芽分化,但对‘企剑白墨’的影响不显著;与‘企剑白墨’相比,芽分化过程中YUC类候选基因在‘小凤兰’中表达上调,GH3类候选基因表达下调,两者共同影响了分化第一阶段的生长素含量。CsAHK4比CxAHK4多了一段核苷酸序列,而CsCKX9比Cx CKX9少了两段核苷酸序列,说明可能存在可变剪切;CsAHK4编码的蛋白有完整的细胞分裂素感受器结构,能够感受细胞分裂素信号;与‘小凤兰’相比,AHK4和CKX9均在‘企剑白墨’芽分化过程中表达上调。CsCYP450和CxCYP450蛋白序列一致性仅为87.30%,进化分析表明来自‘小凤兰’的CxCYP450与小兰屿蝴蝶兰的PeCYP450关系更近,其蛋白序列包含一个假定的ω-脂肪酸羟化酶保守区,可能与某种重要的脂类化合物的合成有关;与‘小凤兰’相比,CYP450在‘企剑白墨’离体幼嫩组织器官中表达量较低。通过上述研究,建立了易工厂化繁殖的墨兰资源创建的技术体系,获得2份易工厂化繁殖墨兰资源,进一步明确‘小凤兰’和‘企剑白墨’墨兰组培快繁能力的差异及其生理机理,筛选出与墨兰芽分化能力相关的候选基因,为深入了解墨兰根状茎分化的分子机理、培育易工厂化繁殖墨兰新品种奠定坚实的物质和技术基础。