IFN-γ是一种多效细胞因子,对机体的免疫和营养代谢具有重要的调节作用。课题组前期发现,日常饲喂奶牛玉米秸秆饲料可导致其机体内IFN-γ水平升高,升高的IFN-γ进一步诱导奶牛乳腺细胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)精氨酸耗竭,并成为后续奶牛泌乳能力下降、细胞恶性增殖等一系列疾病的诱因。但是,IFN-γ诱导BMECs精氨酸耗竭的机制尚不清楚。为此,本研究通过体外培养MAC-T细胞系,参考课题组前期所做的IFN-γ作用于BMECs与对照组的转录组学数据,从精氨酸转运和代谢角度入手,探究IFN-γ诱导精氨酸耗竭的机制。本研究丰富了营养与免疫的分子机制,为改善奶牛的泌乳能力及抗病能力提供了一定的理论基础。首先,为确定IFN-γ对胞外精氨酸向胞内转运的影响,本研究通过荧光定量PCR和ELISA方法,检测IFN-γ作用后参与精氨酸转运相关分子的表达变化。研究结果表明,IFN-γ可通过降低阳离子氨基酸转运蛋白1(Cationic Amino Acid Transporter-1,CAT-1)的表达,抑制胞外精氨酸向胞内转运。此外,课题组前期发现,IFN-γ可抑制参与精氨酸合成的精氨酸代琥珀酸合成酶1(Argininosuccinate synthase1,ASS1)活性。本研究在此基础上,运用ELISA方法丰富了IFN-γ对精氨酸代谢相关酶活力影响的检测,并且通过荧光定量PCR和Western blot进一步发现,IFN-γ抑制MAC-T细胞中ASS1表达。为进一步研究IFN-γ诱导BMECs精氨酸耗竭的机制,本研究参考课题组前期所做的转录组学数据,筛选IFN-γ作用后参与精氨酸代谢的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并通过荧光定量PCR方法确证DEGs。为确定所筛选基因与胞内精氨酸含量的相关性,本研究通过向细胞内转染相应基因的干扰质粒,确定其抑制效果后,运用高效液相色谱质谱联用仪检测胞内精氨酸含量。结果显示,肌肽合成酶1(Carnosine synthase 1,CARNS1)、半胱氨酸-tRNA合成酶2(Cysteinyl-tRNA synthetase 2,CARS2)、亮氨酸氨基肽酶3(Leucine aminopeptidase 3,LAP3)参与IFN-γ诱导的胞内精氨酸耗竭。此外,荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光等结果显示,抗体封闭IFN-γ受体2(Interferon-γreceptor 2,IFNGR2)或p38 MAPK抑制剂(SB203580)预处理可显著降低IFN-γ对CARNS1和ASS1的影响。最后,本研究通过RNAi技术、荧光定量PCR、Western blot及ELISA等实验发现,敲降CARNS1可显著抑制ASS1的活性和表达。综上所述,本研究发现奶牛日常饲喂玉米秸秆饲料导致的IFN-γ升高,可通过IFNGR2-p38-CARNS1-ASS1通路抑制精氨酸内源合成,诱导BMECs中精氨酸耗竭。该研究揭示了IFN-γ诱导BMECs精氨酸耗竭的机制,为精氨酸耗竭导致的各种疾病治疗提供了一定理论基础。