目的:核糖体是细胞中合成蛋白的细胞器,是由核糖体蛋白(r-protein)和核糖体RNA(rRNA)组成的大分子复合物。在快速生长的酵母细胞中,5500 nt RNA和79个核糖体蛋白经过复杂的成熟过程,每分钟能产生约2000个核糖体,最终在整个细胞中约含200000个核糖体,其蛋白含量约占蛋白总量的50%,如此大量的产生并存在于细胞中,维持其稳态必然需要存在一种机制来降解过量的核糖体。真核细胞中自噬系统和泛素蛋白酶体系统是降解蛋白的主要途径。泛素蛋白酶体系统,通过识别泛素标签,依赖蛋白酶体降解蛋白。自噬系统,很多细胞器,大分子复合物和蛋白通过自噬系统降解。最初认为核糖体是被随机的包裹进入自噬体,然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体进一步降解。Claudine Kraft等人在芽殖酵母中发现核糖体存在选择性自噬,称作核糖体自噬“Ribophagy”。在相关研究中,主要有三种因素参与其中,泛素化修饰与去泛素化,特定药物诱导,自噬受体。Rpl3(ribosomal protein L3)是核糖体大亚基蛋白,可以促进翻译延长准确性,是关键且保守的核糖体蛋白。本实验中,我们将在裂殖酵母中对核糖体大亚基蛋白Rpl3的降解途径进行研究。方法:应用同源重组方法在Rpl3羧基端标记绿色荧光蛋白GFP,通过Spot assay实验确定标记蛋白的核糖体组装情况。使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂Cycloheximide(CHX),通过免疫印迹和荧光显微镜检测,确定泛素蛋白酶体系统的调控。用饥饿诱导自噬,免疫印迹检测自噬。通过四分子解剖实验得到自噬核心基因敲除(atg1?,atg5?)和rrp14?合并Rpl3-GFP菌株。利用分子克隆方法构建质粒,结合PCR,大肠杆菌转化与DNA测序对目的基因定点突变。应用醋酸锂转化法结合酶处理的线性化质粒将目的基因序列转入酵母基因组。利用Pil1共锚定实验,免疫共沉淀及酵母双杂交实验确定蛋白间相互作用。应用质谱,Pil1共锚定实验,及iLIR v1.0 WWW Server序列预测寻找核糖体自噬受体。结果:Spot assay结果表明Rpl3-GFP蛋白能正确组装进入核糖体。经过MG132和CHX处理,结果表明泛素蛋白酶体系统不参与Rpl3的调控。饥饿诱导自噬可以降解Rpl3,自噬核心基因atg5敲除后,饥饿诱导并不引起Rpl3蛋白降解,表明自噬参与了Rpl3的调控。对比与观察Rpl3泛素化位点突变蛋白与野生型蛋白自噬情况,证明泛素化修饰不影响Rpl3的自噬调控。在裂殖酵母中,DTT诱导及缺少氨基酸或核苷酸可以引起自噬,导致Rpl3被降解。rrp14基因敲除影响蛋白含量,但是不影响Rpl3的自噬降解。NUFIP1的酵母同源蛋白Rsa1及其Rpf2蛋白等不是核糖体受体。核糖体大亚基蛋白Rpl3以不依赖于泛素化修饰的自噬途径降解。结论:1.在裂殖酵母中,Rpl3不通过泛素蛋白酶体系统降解,而是通过自噬系统调控。2.泛素化修饰不影响Rpl3的自噬降解,DTT和缺少氨基酸或核苷酸可以引起自噬降解Rpl3。3.Pol5和Rsa1非核糖体自噬受体,可以通过综合分析与实验寻找核糖体受体。