1.研究背景和意义Fractalkine（FKN,亦称CX3CL1）是趋化因子CX3C亚类中的唯一成员,通过与受体CX3CR1特异性结合,募集炎症细胞而在动脉粥样硬化的病理过程中发挥重要的作用。但是其在调节动脉粥样硬化性钙化中的作用尚不明确。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的成骨表型转化在动脉粥样硬化发展为动脉粥样硬化性钙化中起到重要作用,我们的研究第一次探讨了FKN/CX3CR1在VMSC成骨转化及动脉粥样硬化性钙化过程中的作用,并研究了FKN/CX3CR1在VSMC成骨表型转化中的分子信号通路。载脂蛋白E（Apo E）是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白残留的受体配体。缺乏载脂蛋白E(Apo E^-/-)的小鼠被广泛用作研究动脉粥样硬化发病机制和动脉粥样硬化性钙化的遗传和环境因素的模型[15,16]。本研究应用Apo E和CX3CR1双基因缺陷小鼠(Apo E^-/-/CX3CR1^-/-),观察CX3CR1缺陷对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化性钙化斑块形成的影响,并检测FKN/CX3CR1在VSMCs中的表达;通过检测成骨转化标志蛋白（包括骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP））以及VSMCs标志蛋白（包括平滑肌α-肌动蛋白（smooth muscleα-actin,α-SMA）、平滑肌22α蛋白（smooth muscle 22α,SM22α））的表达,明确FKN/CX3CR1对VSMC成骨转化的影响;应用慢病毒转染的方法敲低或过表达VSMCs中CX3CR1水平,探讨FKN/CX3CR1在VSMC成骨转化中的作用;进一步应用Jak激酶2（Janus kinase 2,Jak2）及Stat（signal transducer and activator of transcription,Stat）抑制剂AG490,探讨FKN/CX3CR1是否通过Jak/Stat信号通路调控Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）以及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）的表达,以及破骨细胞转录因子（核因子-κB受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK））和其配体RANKL的表达,进而阻断RUNX2激活的VSMC成骨转化和动脉粥样硬化性钙化。总之,本研究探讨FKN/CX3CR1通过Jak2/Stat3信号通路激活RUNX2、抑制OPG的表达,进而促进VSMC成骨转化和调节动脉粥样硬化性钙化的重要作用和分子机制,旨在为预防和治疗动脉粥样硬化性钙化提供新的策略及思路。2.材料与方法（1）构建高脂诱导的ApoE^-/-及ApoE^-/-/CX3CR1^-/-的动脉粥样硬化性钙化实验小鼠模型通过将Apo E^-/-小鼠（华阜康,中国）与CX3CR1^-/-小鼠（No.005582,美国杰克逊实验室）杂交产生Apo E^-/-/CX3CR1^-/-双基因敲除小鼠,由于既往文献报道RANK和RANKL与女性雌二醇和孕激素密切相关[17],因此本研究仅选取Apo E^-/-及Apo E^-/-/CX3CR1^-/-的雄性小鼠用于实验。Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠通过PCR方法进行鉴定,并将Apo E^-/-及Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠寄养于SPF级动物房中并给予高脂饮食饲喂30周。高脂饲料（含一般材料78%,猪油16.4%,植物油3.6%,植物油2%）由陆军特色医学中心实验动物中心提供。（2）原代血管平滑肌细胞培养及细胞钙化模型的建立离体实验中,本课题采用6至8周龄野生型C57BL/6J小鼠、Apo E^-/-小鼠及Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠3种小鼠的胸主动脉VSMCs进行原代培养,选取第3-8代细胞用于实验。贴块法培养血管平滑肌原代细胞,将细胞放置于含有5%CO2的37℃恒温细胞培养箱培养,直至细胞从组织块周围爬出。将上述细胞以5×105个细胞/ml的密度接种于6孔板中,并在含有10%胎牛血清,青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的高糖培养基中培养24小时。24小时后移除旧培养基,并用成骨培养基（OM）代替以建立钙化模型,该实验所用成骨培养基由高糖培养基、10%胎牛血清、青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）、10m Mβ-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸以及10-8 mol/L地塞米松组成,并同时在该成骨培养基中加入不同浓度的重组小鼠趋化因子FKN（R&D Systems,258-MF）（0,10,30,50ng/ml）继续培养,根据细胞生长速度及细胞密度,每2-3天更换新鲜成骨培养基。（3）构建CX3CR1基因敲低及过表达的小鼠血管平滑肌细胞模型将带有CX3CR1敲低和过表达的慢病毒载体转染野生型小鼠VSMCs,构建出CX3CR1敲低及过表达的VSMCs。将与小鼠基因序列无关的sh RNA作为阴性对照（sh Control）,在CX3CR1敲低载体的转染实验中,将野生型小鼠VSMCs以5×104细胞/孔的密度接种到24孔板中,并在无血清生长培养基中孵育。当细胞融合度达到约50%时,将慢病毒以30的感染复数进行转染（MOI=30）。3-4天后,通过GFP阳性细胞/总细胞的百分比评估转染效率,并通过免疫印迹印迹和RT-PCR分析转染效率。CX3CR1过表达载体的转染及验证过程与上述描述的相同。（4）血管平滑肌细胞钙化、小鼠主动脉及其切片钙化的定性及定量检测当VSMCs在成骨培养基以不同浓度的FKN（0,10,30,50ng/ml）培养7或14天后,吸弃旧培养基后用PBS轻洗,加入4%多聚甲醛常温固定15分钟。固定后用PBS冲洗3次后加入1%茜素红染液（p H 4.2,Sigma-Aldrich）5分钟后吸弃,染色后用双蒸水冲洗3次,在显微镜下观察钙化结节。接下来量化分析茜素红染色程度,用10%的十六烷氨基吡啶将上述处理的VSMCs脱钙,450nm用分光分度计检测OD值。Apo E^-/-和Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠生理盐水灌注、主动脉弓部分取材,用4%多聚甲醛常温固定24小时后,将主动脉组织块在一系列浓度梯度乙醇中脱水后,包埋在石蜡中,切成3μm厚的连续切片,并用茜素红染色以检测血管钙化情况。苏木精和伊红（H&E）染色也用于查看切片。在室温下用1%茜素红染液染色15分钟,染色后将主动脉和主动脉切片用双蒸水洗涤3次。通过邻甲酚酞络合物比色法（Calcium Kit,Abcam）检测主动脉弓部分钙浓度。（5）免疫荧光及共聚焦显微镜实验细胞免疫荧光共聚焦实验中,将贴壁小鼠VSMCs在磷酸盐缓冲液（PBS）中冲洗,并在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟;组织免疫荧光共聚焦实验中,将主动脉弓部分的血管组织埋入OCT胶（Tissue-Tek,Alle-giance）切成7μm厚的切片备用,继而将细胞贴片或组织贴片用0.1%Triton-100打孔10分钟,再用PBS洗涤,然后在室温下用5%驴血清封闭1小时,加入一抗并在4℃下湿盒中孵育过夜,用PBS中洗涤未结合的一抗,然后在室温下孵育二抗1小时,用PBS洗涤3次后,然后用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育以染色细胞核,然后加入防荧光淬灭封片剂封片。用共聚焦显微镜（Leica,German）拍照。（6）免疫印迹通过细胞裂解液获得蛋白样品,并采用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific,USA）测定蛋白质浓度。蛋白质样品通过SDS-PAGE分离胶并转移至NC膜（Bio-Rad,Hercules,美国）,将膜在含有0.05%Tween-20（TBST）和5%脱脂奶粉的TBS中在室温下封闭1小时,然后在4℃下,一抗孵育过夜。用TBST洗涤后,将膜与第二抗体在室温下孵育2小时。使用Odyssey扫描仪软件（Li-COR Bioscience）扫描蛋白质,并使用Image J 6.0进行定量。不同蛋白的表达与对照组蛋白表达进行标准化比较。（7）RT-PCR用RNA分离试剂盒（Sangon Biotech,中国上海）从VSMCs中分离总RNA。使用i Script逆转录试剂（Bio Rad,US）将RNA逆转录为c DNA,使用2íSYBR green PCR预混液（Bimake,China）,然后进行定量实时聚合酶链反应。将样品加热到95℃3分钟,然后进行39个循环:95℃10s,57℃30s,72℃10s,72℃10s,65℃5s和95℃5s,最终4℃保存。各基因表达用-??CT公式与对照组的基因表达进行标准化比较。（8）统计分析除非另有说明,结果均以平均数±标准误的形式表示,所有实验均至少进行三次独立实验。两组之间的比较采用Student T-test,组间比较采用one-way ANOVA或者two-way ANOVA重复检验方法（重复测量方差分析,repetitive measurement deviation analysis）并应用Tukey多重比较测试进行比较。使用Graph Pad Prism 7.0软件绘制数据,当P<0.05说明上述结果具有统计学差异。3.结果（1）CX3CR1^-/-缺陷抑制高脂饮食诱导的小鼠的主动脉粥样硬化性钙化和血管平滑肌细胞的成骨转化Apo E^-/-小鼠和Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠均给予30周的高脂饮食后取主动脉弓,Apo E^-/-小鼠主动脉弓切片中,通过茜素红染色可发现明显可见的血管钙化灶;在Apo E^-/-/CX3CR1^-/-双基因敲除小鼠主动脉切片中并未见到明显钙化斑块。此外,定量分析显示Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠主动脉内钙含量明显低于Apo E^-/-小鼠。与此相一致的是,成骨标志物（包括OPN、BMP2和ALP）在Apo E^-/-小鼠的主动脉中大量表达,但在Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠的主动脉中没有明显表达。FKN（50ng/ml）孵育Apo E^-/-小鼠VSMCs7天后,OPN、BMP2和ALP蛋白表达水平显著升高,而Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠VSMCs未观察到明显增强。在浓度为50ng/ml FKN孵育7天的Apo E^-/-小鼠主动脉取材培养的VSMCs中成骨标志蛋白（包括OPN、BMP2和ALP）明显表达,但并未在Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠VSMCs中发现明显的表达增强。（2）FKN及其特异性受体CX3CR1均在血管平滑肌细胞中表达;氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可上调FKN/CX3CR1的表达分别采用免疫印迹法及RT-PCR法检测了FKN及CX3CR1在VSMCs中的蛋白和m RNA表达。结果显示,FKN及CX3CR1在VSMCs的细胞膜及胞质中均有表达。氧化型低密度脂蛋白（40μg/ml）孵育VSMCs72小时后,FKN及CX3CR1的表达量均有显著升高,提示FKN及CX3CR1可通过高脂诱导途径参与了VSMC成骨转化。（3）FKN/CX3CR1促进血管平滑肌细胞的成骨转化及钙化将VSMCs在浓度梯度的FKN（0,10,30,50ng/ml）中培养7天及14天后发现,FKN以浓度依赖性的方式诱导VSMC成骨转化（FKN浓度为50 ng/ml的成骨培养基中培养14天时,VSMCs钙化程度达到的峰值）,表现为茜素红染色显示红色钙化结节增多,脱钙后的OD值升高,以及成骨标志物（包括OPN、BMP2和ALP）的蛋白和m RNA表达水平显著上调,与此同时,VSMCs标志物α-SMA和SM22-α的蛋白和m RNA表达显著减少。为了进一步明确FKN/CX3CR1在VSMCs向成骨转化中的作用,本研究使用慢病毒介导的方法分别敲低和过表达VSMCs中的CX3CR1水平。结果表明,CX3CR1敲低抑制FKN（50ng/ml）诱导的VSMCs中成骨标志物（包括OPN、BMP2和ALP）的表达,而CX3CR1过表达则促进了FKN诱导的VSMCs中成骨标志物的表达。（4）RUNX2、RANK/RANKL和OPG参与了FKN/CX3CR1调控的VSMC的成骨转化和动脉粥样硬化性钙化FKN浓度依赖性地促进VSMCs中RUNX2蛋白和m RNA水平的表达,在50ng/ml FKN孵育14天时达到峰值;与此相一致,RANK和RANKL的蛋白及m RNA表达也呈浓度依赖性增高,而血管钙化抑制因子OPG的蛋白及m RNA表达量则在FKN浓度为50ng/ml时显著下降。CX3CR1敲低的VSMCs中,FKN（50ng/ml）诱导的RUNX2的表达显著低于野生型VSMCs;而OPG的表达高于野生型VSMCs。而在CX3CR1过表达的VSMCs中,FKN（50ng/ml）诱导的RUNX2表达显著高于野生型VSMCs;而OPG的表达低于野生型VSMCs。高脂饮食诱导30周后,Apo E^-/-小鼠主动脉中RUNX2、RANK和RANKL大量表达,而Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠主动脉则无明显表达。共聚焦显微镜观察发现,RUNX2、RANK和RANKL与α-SMA共定位表达,提示主动脉的VSMCs中存在活跃的成骨过程;作为成骨过程的抑制因子,在Apo E^-/-和Apo E^-/-/CX3CR1^-/-小鼠主动脉中OPG的表达则与RUNX2、RANK/RANKL相反。提示RUNX2、RANK/RANKL活化和OPG抑制共同参与了FKN/CX3CR1调控的VSMC成骨转化和动脉粥样硬化性钙化。（5）Jak2/Stat3信号通路介导了FKN诱导的血管平滑肌细胞的成骨转化Jak/Stat是参与成骨细胞中合成代谢的信号通路并调节成骨转化的重要分子。本研究发现FKN（50ng/ml）可促进Jak2和Stat3的磷酸化,从而激活Jak2/Stat3信号通路。Jak2特异性拮抗剂AG490显著抑制FKN诱导的RUNX2、OPN、BMP2和ALP的表达。4.结论本研究发现FKN及其特异性受体CX3CR1在高脂诱导的动脉粥样硬化性钙化和VSMC成骨转化中起重要作用,其分子机制为激活Jak2/Stat3信号通路,上调RUNX2、RANK/RANKL以及其他成骨标志蛋白的表达,同时抑制抗钙化蛋白OPG的表达,最终促进VSMCs转化为成骨表型,促进动脉粥样硬化性钙化病灶的形成。FKN/CX3CR1作为动脉粥样硬化性钙化的关键调控分子,对其进行有效干预可能同时起到抑制炎症反应和动脉粥样硬化性钙化的作用,从而为防治动脉粥样硬化性钙化以及心脑血管疾病提供新的治疗靶点和干预措施。