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研究背景和目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种对称性侵袭关节及其周围组织的慢性系统性自身免疫性疾病,以持续性反复发作的关节滑膜炎为主要临床特征,病变后期可造成患者关节畸形、活动受限,并累及皮肤、肺、心脑血管系统,预后较差。中性粒细胞作为天然免疫系统中数量庞大的细胞群,在RA外周血和关节腔滑膜液中数量显著增多。既往研究发现中性粒细胞通过多种途径促进RA滑膜炎症,加重关节骨破坏,我们课题组在前期工作中筛选了升麻的三个有效单体,发现升麻和这三个单体能不同程度的减轻胶原诱导的类风湿关节炎(Collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA)小鼠关节红肿和骨破坏程度、改善关节炎症,降低CIA小鼠骨髓、脾脏中性粒细胞比例,降低CIA小鼠血浆粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)和关节组织中性粒细胞趋化因子水平。本文以中性粒细胞为出发点,探讨升麻和这三个有效单体对中性粒细胞的调控作用,阐明升麻治疗RA的作用机制,以期为升麻治疗RA提供实验依据,为临床治疗RA提供新思路。研究方法:SD大鼠40只,雄性,8-12周,体重300±50g,给药前禁食不禁水4小时,分别给予生理盐水和临床等效剂量的升麻水煎液灌胃1.2g/kg/d(成人每次用药临床常用剂量:升麻12g/60kg体重),每12小时1次,共5次,制备空白血清和升麻含药血清。采用体外培养骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs),不同浓度的升麻含药血清处理后,LPS和IFN-γ刺激,分别通过Real-time PCR和ELISA法检测炎性细胞因子的表达和分泌水平,确定升麻含药血清干预最佳剂量;通过流式细胞仪分选正常小鼠骨髓和外周血中性粒细胞并鉴定纯度。中性粒细胞预先用升麻含药血清和升麻三个有效单体处理1h后,1)给予趋化因子CXCL2,CXCL10和CCL3诱导3h,流式细胞仪检测趋化的中性粒细胞数量,研究升麻和升麻三个单体对中性粒细胞趋化作用的影响。2)LPS刺激20h,流式细胞仪检测外周血中性粒细胞凋亡情况,研究升麻和升麻三个单体对中性粒细胞凋亡的影响。3)LPS刺激3h,Real-time PCR和CBA法检测炎性细胞因子的表达和分泌水平,研究升麻对中性粒细胞活化后合成和分泌细胞因子的影响。4)PMA刺激5min,流式细胞仪检测骨髓中性粒细胞产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)情况,研究升麻和升麻三个单体对中性粒细胞活化后呼吸爆发功能的影响。5)LPS刺激3h,PicoGreen法检测细胞培养上清游离DNA(cell-free DNA,cf-DNA)的含量,免疫荧光法检测中性粒细胞形成的中性粒细胞诱捕网(Neutrophil extracellulartraps,NETs)情况,研究升麻和升麻三个单体对中性粒细胞活化后形成NETs的影响研究结果:1.通过流式细胞仪分选正常小鼠骨髓和外周血中性粒细胞,鉴定纯度≥95%;确定10%的升麻含药血清为最佳用药浓度。2.CXCL2,CXCL10及CCL3诱导3h,趋化至下室的中性粒细胞数目显著增多,且CXCL2诱导作用最强;升麻含药血清和升麻单体黄肉楠碱(Actein)均能有效抑制CXCL2、CXCL10、CCL3诱导的中性粒细胞趋化;升麻单体脱氧升麻亭(23-EPI-26-Deoxyactein,23-EPI)、异阿魏酸(Isoferulic acid,IFA)还可有效抑制CXCL2诱导的中性粒细胞趋化。3.LPS刺激20h后,外周血中性粒细胞凋亡显著减少,升麻含药血清、升麻单体Actein,23-EPI和IFA能不同程度的促进中性粒细胞凋亡。4.LPS刺激3h后,中性粒细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12b和TNF-αmRNA的表达显著升高,升麻含药血清能显著抑制中性粒细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12b和TNF-α mRNA的表达;中性粒细胞分泌炎性细胞因子IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ、MCP-1和TNF-α的水平均显著提高,升麻含药血清能显著降低培养上清中IL-12p70、IFN-γ和MCP-1水平。5.PMA刺激5min,中性粒细胞活化产生ROS显著增多,升麻单体23-EPI、IFA能显著抑制中性粒细胞产生ROS。6.LPS和PMA刺激3h,中性粒细胞培养上清中cf-DNA含量增多、中性粒细胞释放NETs增加,升麻含药血清、23-EPI、IFA均能显著减少LPS诱导的细胞培养上清cf-DNA含量,升麻含药血清和IFA均能显著减少PMA诱导的细胞培养上清cf-DNA含量;免疫荧光结果显示升麻含药血清和升麻单体能不同程度的抑制中性粒细胞活化后释放NETs。结论:中性粒细胞体外给予趋化因子CXCL2、CXCL10、CCL3诱导后,趋化能力显著增强;给予LPS或PMA刺激后,合成和分泌细胞因子水平,产生ROS和NETs显著增加,凋亡活动受到抑制。升麻和三个有效单体抑制中性粒细胞活化,抑制中性粒细胞合成和分泌炎性细胞因子、ROS产生和NETs形成,抑制中性粒细胞趋化,并促进中性粒细胞凋亡。结合前期体内实验结果,我们认为:升麻通过调控中性粒细胞数目和功能,从而减缓、抑制RA的发生、发展。