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糖尿病目前是导致人类致残的第七大原因,在过去30年糖尿病病人数增长了一倍。跟正常人相比,糖尿病病人有着更高的心律失常发生率。其较高的心律失常发生率同心脏中异常缝隙连接蛋白及自噬有着较强的关系。心脏正常的生理活动需要心肌细胞之间正常的电偶联以及电传导,这与正常分布以及数量的缝隙连接蛋白相关。在心室肌细胞中,缝隙连接蛋白43(Cx43)是心室中的主要缝隙连接蛋白,而Cx40以及Cx37也少量存在于心室肌中。目前认为Cx43是维系心室正常电生理活动最重要的缝隙连接蛋白。既往研究发现高糖环境下,新生乳鼠心肌细胞Cx43表达明显下调,而在Ⅰ型糖尿病模型中,Cx43的表达量随着造模时程而发生变动。在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠模型中,造模成功3周后大鼠Cx43表达量明显降低,然而,造模成功3个月的SD大鼠,其Cx43却因长期高糖导致的代谢产物的影响而明显上调。Cx43的表达量以及分布的变化,在糖尿病的病程发展中受很多因素影响,目前机制尚未完全明了。因此,为避免混杂因素干扰,本实验主要探讨高糖刺激对心肌细胞的影响,并在3周左右的大鼠体内予以证实。而同时,在糖尿病病人中,自噬的异常也是导致糖尿病病人发生心律失常的重要原因之一,诱导造模的2型糖尿病小鼠中,3个月左右可以发现小鼠心脏自噬明显增强,而对其自噬活动调节,可以一定程度上改善小鼠异常的心脏活动。茶黄素(TF)是茶叶在初步发酵产生儿茶素后被多酚氧化酶进一步高度催化的产物,主要包括茶黄素(TF1),茶黄素3-单没食子酸酯(TF2a),茶黄素3’-单没食子酸脂(TF2b),茶黄素-3,3-双没食子酸酯(TF3),其中,TF3是茶黄素的主要成分。相较于儿茶素,茶黄素有更高的抗氧化活性,其中,TF3有着最强的抗氧化能力。既往研究发现茶黄素有一定的治疗生物体脂毒性以及缺血-再灌注损伤的作用。此外,茶黄素能够减轻血管紧张素Ⅱ,内皮素等对心血管疾病造成的毒副作用。然而,对于茶黄素对糖尿病的作用报道,目前尚不十分充裕。在本研究中,我们首先观察高糖对新生乳鼠心肌细胞自噬和缝隙连接蛋白的影响,然后观察TF3能否逆转高糖对心肌细胞自噬以及缝隙连接蛋白的影响。此外,TF3在心肌细胞中的调控机制也进行了探讨。最后,在STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠中,验证TF3在体内的作用。第一部分 茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(TF3)对高糖环境下新生乳鼠心肌细胞自噬及缝隙连接功能的影响及机制探讨目的研究高糖环境对乳鼠心肌细胞缝隙连接蛋白(Cx)及自噬的影响,并观察TF3对高糖环境下心肌细胞的保护作用及机制探讨。方法提取出生1-2天新生SD大鼠心肌细胞(NRCM),将其用高糖(33mM葡萄糖)培养72h,同时,加入TF3共培养,使用Westem blot观察心室相关缝隙连接蛋白(Cx43,Cx37,Cx40)及自噬相关蛋白(LC3-II,Beclin1)表达量的改变。同时,通过荧光素黄/罗丹明红(LY/Rhd)传输实验评估缝隙连接功能。同时,使用mCherry-GFP-LC3腺病毒转染心肌细胞,共聚焦显微镜下进行自噬点计数。此外,通过检测磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶(磷酸化AMPK),AMPK蛋白表达量,观察AMPK活性的变化。为了验证AMPK在TF3对心肌细胞保护中的作用,通过5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷(AICAR)激活AMPK,AMPK小千扰RNA(siAMPK)下调AMPK的表达,观察缝隙连接蛋白及自噬相关蛋白的表达。最后,通过3-甲基腺嘌呤(3-MA),巴佛洛霉素A1(bafA1)抑制自噬,雷帕霉素上调自噬,观察自噬对缝隙连接蛋白的影响;另一方面,通过Cx43小干扰RNA(siCx43)下调缝隙连接蛋白的表达,观察缝隙连接蛋白对自噬的影响。结果高糖环境下NRCM缝隙连接蛋白43以及自噬相关蛋白明显下调,TF3能呈剂量依赖性及时间依赖性的上调Cx43及自噬相关蛋白的表达,而Cx37及Cx40的表达不受明显影响。同时,TF3能够逆转高糖环境对缝隙连接功能的抑制及增加自噬点计数。高糖能够抑制AMPK活性,TF3可以显著逆转心肌细胞内被抑制的AMPK的活性。用AICAR激活AMPK可以取得与TF3治疗类似的效果,而将TF3上调AMPK活性的作用通过siAMPK敲除后,TF3对高糖环境下心肌细胞的保护作用明显减弱。另一方面,自噬激活增加了 Cx43的降解,而在心肌细胞内加入baf A1可以明显增加Cx43的表达。而通过siCx43降低心肌细胞内Cx43的表达却对自噬相关蛋白无明显影响。结论TF3能够逆转高糖环境对乳鼠心肌细胞缝隙连接蛋白及自噬相关蛋白的抑制,这过程同上调AMPK活性部分相关。高糖环境下心肌细胞自噬的抑制可能对缝隙连接蛋白存在一定的保护作用。第二部分 茶黄素对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠缝隙连接蛋白功能及机制探讨目的研究茶黄素对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病SD大鼠缝隙连接蛋白及相关机制。方法用STZ(55mg/kg)尾静脉注射200g雄性SD大鼠构建Ⅰ型糖尿病模型,并予以茶黄素(10mg/kg)连续灌胃3周。大鼠心脏超声观察大鼠心功能变化,免疫印迹观察缝隙连接蛋白43(Cx43)及磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶(磷酸化AMPK)和AMPK蛋白表达量变化,免疫组化观察Cx43表达及分布情况。结果STZ诱导1型糖尿病大鼠3周未导致明显大鼠心功能改变。蛋白印迹提示STZ处理3周后Cx43,AMPK活性明显下调,免疫组化提示Cx43在心室中表达及存在明显异常。茶黄素处理可以上调AMPK活性及部分逆转高糖导致的Cx43表达及分布异常。结论茶黄素能够逆转STZ诱导的1型糖尿病大鼠导致的AMPK活性抑制及Cx43表达和分布异常。