【摘 要】
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巨自噬（即通常所说的自噬）是真核生物中的一类运送受损蛋白质等有害物质到溶酶体或液泡进行降解并被重新利用的过程。自噬过程通常包括自噬前体的诱导、成核、延伸、闭合及成熟自噬体与溶酶体或液泡的融合、自噬体内容物的降解和释放等步骤。所在实验室已报道Rab5/Vps21模块蛋白除了参与内吞途径还参与自噬途径,缺失后自噬前体无法封口,部分原因是Vps21模块蛋白缺失后无法募集转运必需内体分选复合物（ESCRT
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巨自噬（即通常所说的自噬）是真核生物中的一类运送受损蛋白质等有害物质到溶酶体或液泡进行降解并被重新利用的过程。自噬过程通常包括自噬前体的诱导、成核、延伸、闭合及成熟自噬体与溶酶体或液泡的融合、自噬体内容物的降解和释放等步骤。所在实验室已报道Rab5/Vps21模块蛋白除了参与内吞途径还参与自噬途径,缺失后自噬前体无法封口,部分原因是Vps21模块蛋白缺失后无法募集转运必需内体分选复合物（ESCRT）至自噬前体催化自噬前封口。此外,Vps21模块蛋白还显著影响在内吞途径和自噬途径中均发挥功能的磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶（PI3K）复合体亚基Vps34的定位情况,然而并不清楚Vps21模块蛋白怎样通过Vps34调控自噬,尤其是自噬前体的闭合。本研究发现Vps21模块蛋白缺失不仅降低PI3K复合体、磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）、Atg21和Atg12-Atg5-Atg16复合体在Snf7标记的内体或（和）Ape1标记的自噬体组装位点（PAS）的定位比例,更重要的是减弱Vps21下游效应蛋白Vps8与Vps34,Atg21与Atg16以及Atg21与Atg8的互作。这些定位和互作的减弱可能是Vps21模块蛋白通过ESCRT复合体以外调控自噬体封口的其他原因,但详细的调控机制有待更深入的研究。本研究主要结果如下:1.Vps21缺失导致PI3K复合体、PI3P、Atg21及Atg12-Atg5-Atg16复合体在内体或（和）PAS的定位比例下降。PI3K复合体亚基Vps34磷酸化磷脂酰肌醇（PI）产生的PI3P可以募集其结合蛋白Atg21等至内体和自噬前体,同时Atg21也可以募集下游泛素化蛋白Atg12-Atg5-Atg16复合体至自噬前体。为了探究Vps21是否通过PI3K复合体及其下游系列蛋白参与自噬,尤其是自噬前体封口,本研究检测了 Vps21缺失后这一系列蛋白在内体或（和）PAS的定位变化。发现PI3K复合体亚基Vps38、Vps34和Atg14以及PI3P结合蛋白Atg21在内体或（和）PAS的定位均受氮饥饿诱导和Vps21缺失影响,更为重要的是,有些细胞中Vps38或Vps34可在Snf7-mTu和RFP-Ape1标记的同一位点定位,且依赖于Vps21,虽然Vps21缺失后它们在内体的定位比例下降更为明显。另外,与营养丰富条件相比,氮饥饿诱导下Atg12-Atg5-Atg16复合体在PAS的定位比例显著增加,而Vps21缺失后,比例显著下降。2.Vps21缺失突变体中PI3K复合体、Atg21以及Atg12-Atg5-Atg16复合体在内体或（和）PAS定位比例的下降并非因其表达量减少所致。为了探究Vps21缺失突变体中PI3K复合体、Atg21以及Atg12-Atg5-Atg16复合体在内体或（和）PAS定位比例下降是否因这些蛋白表达量减少所致,本研究检测了它们的表达量。发现在vps21Δ突变体中这些蛋白的表达量并未显著减少,反而Vps38的表达量有所增加,说明Vps21缺失并非通过减少这些蛋白的表达量来降低它们在内体或（和）PAS的定位比例。3.Vps21缺失减弱Vps8与Vps34,Atg21与Atg16以及Atg21与Atg8之间的互作,并且后两种互作可以发生在Snf7-mTu和RFP-Ape1标记的同一位点。所在实验室已通过双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）等技术发现Vps8与Vps34存在互作,且互作发生在Snf7标记的内体而不是Atg8标记的自噬体,并且这一互作依赖于Vps21。本研究进一步通过对酵母来源蛋白用GST pulldown技术验证该互作;也通过BiFC和Y2H技术检测到Atg21与Atg16,Atg21与Atg8存在互作,且互作发生在Atg8标记的自噬体上,也依赖于Vps21,由于内体与自噬体可以发生紧密的接触,因此很有必要去了解这些互作是否也发生在内体上,研究结果显示这些互作也可以发生在内体,更重要的是它们的互作可以发生在Snf7-mTu和mCherry-Atg8标记的同一位点,虽然比例不超过16%。
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