【摘 要】
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柠檬色明串珠菌(Leuconostoc citreum)是存在于动物乳汁及发酵品中的乳酸菌。L.citreum 37在生长过程中会产生较厚的生物被膜,在细菌抗逆与黏附中发挥重要的作用。本研究探究了群体感应LuxS/AI-2在L.citreum 37生物被膜形成过程中的作用。主要实验结果如下:(1)被膜态菌株的生物被膜形成、AI-2的合成量以及LuxS/AI-2的关键基因表达水平均显著高于浮游态菌株
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柠檬色明串珠菌(Leuconostoc citreum)是存在于动物乳汁及发酵品中的乳酸菌。L.citreum 37在生长过程中会产生较厚的生物被膜,在细菌抗逆与黏附中发挥重要的作用。本研究探究了群体感应LuxS/AI-2在L.citreum 37生物被膜形成过程中的作用。主要实验结果如下:(1)被膜态菌株的生物被膜形成、AI-2的合成量以及LuxS/AI-2的关键基因表达水平均显著高于浮游态菌株(P<0.05),因此,LuxS/AI-2可能参与调控L.citrem 37生物被膜的形成。(2)基于全基因组测序,对L.citreum 37的LuxS/AI-2系统进行分析。结果表明,合成AI-2的基因有Met K、DNMT1、pfs、luxS、mmu M等,其中发挥主要作用的是pfs、luxS基因;参与生物被膜及群体感应相关的信号通路有碳代谢、能量代谢、氨基酸代谢等。(3)大肠杆菌BL21中异源表达L.citreum 37的pfs、luxS,检测重组大肠杆菌BL21的AI-2含量,结果表明luxS重组大肠杆菌的AI-2含量显著高于pfs重组大肠杆菌以及空质粒菌株(P<0.01),所以luxS基因在AI-2合成中发挥关键作用。(4)构建L.citrem 37的luxS同源过表达菌株,其最佳生长温度为33℃,而最佳成膜温度为37℃。过表达菌株生长虽稍滞后于野生型菌株,但过表达菌株中AI-2合成量、生物被膜形成量均显著高于野生型菌株(P<0.05)。(5)通过理化实验以及显微镜等的检测,筛选出调控菌株生物被膜形成的促进剂(0.05%Fe Cl3)和抑制剂(9%D-核糖)。将抑制剂作用于L.citrem37,通过差异蛋白分析,明确了opp A、pel、citE、pgm、GAPDH/gapA、GPI/pgi等基因可能参与L.citrem 37生物被膜的形成。(6)优化确定luxS过表达菌株和野生型菌株在醋酸纤维素纳米纤维膜(Cellulose acetate nanofibers,NCA)上的最佳固定化时间分别为24h和20h。固定化的luxS过表达菌株在模拟胃肠液中的存活率均高于野生型菌株。并且固定于NCA的野生型L.citrem 37和luxS过表达菌株均可循环发酵脱脂乳5次。本研究明确了LuxS/AI-2对L.citrem 37生物被膜形成的调控作用,通过构建luxS同源过表达菌株获得一株生物被膜厚且AI-2合成量高的菌株。为开发和应用高活力被膜态益生菌提供理论基础,为研究其它益生菌的群体感应及生物被膜提供参考。
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