小鼠胚胎干细胞（Mouse Embryonic Stem Cells,m ESCs）来源于着床前囊胚的内细胞团,具有无限自我更新能力。自1981年Martin Evans等人利用饲养层细胞和血清体系第一次建立了m ESCs细胞系,关于m ESCs体外培养体系的研究越来越受到人们关注。2008年Ying等人在化学成分明确的培养基中添加MEK抑制剂PD0325901和GSK3抑制剂CHIR99021（2i）,与白血病抑制因子（LIF）组成了2i/LIF培养体系,就可以使m ESCs处于na?ve状态。2018年,Bao等人通过在化学成分明确的培养基中添加了Activin A、BMP4、CHIR99021和LIF四种因子组成了ABC/L培养体系,并成功利用该体系建立了干细胞系Advanced Stem Cells（ASCs）。通过比较ASCs和m ESCs的转录组数据后发现,Dusp9在ASCs中的表达显著上调,这一现象引起了我们的注意。基于这一发现,我们利用CRISPR-Cas9系统构建了Dusp9敲除的ASCs细胞系,并对该细胞系的多能性、DNA甲基化及发育潜能进行鉴定。进一步,我们通过实时荧光定量PCR、免疫荧光染色分别检测了Dusp9敲除ASCs细胞中DNA甲基化和糖脂代谢相关的基因和蛋白表达变化。结果如下:1.成功建立Dusp9敲除胚胎干细胞系首先我们利用连接有Dusp9-sg RNA的PX-459载体,通过脂质体将重组载体转染到ASCs细胞中,通过PCR产物测序、实时荧光定量PCR和WB等方法验证并成功获得了Dusp9敲除ASCs细胞系。2.Dusp9敲除胚胎干细胞系的转录组结果分析转录组分析结果表明,Dusp9基因敲除影响胚胎干细胞的多能性维持基因和其它相关调控基因的表达。从GSEA分析结果发现,Dusp9高表达组和低表达组之间m TOR和脂肪酸代谢等信号通路也存在显著差异。最后,利用实时荧光定量PCR技术检测了Dusp9敲除细胞系中糖代谢和脂代谢相关基因的表达变化情况。3.Dusp9敲除胚胎干细胞的多能性、DNA甲基化及发育潜能研究首先通过AP染色、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色等方法检测Dusp9敲除胚胎干细胞的多能性,结果表明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有干细胞多能性特征,仍表达Oct4和Sox2多能性特异蛋白。其次,在m RNA和蛋白水平上分别验证了Dusp9缺失导致Dnmt3B表达下降的现象。同时,体外分化实验显示,Dusp9敲除细胞系的三胚层标记基因的表达水平显著高于对照组,说明具有更高的三胚层分化潜力。更重要的嵌合体实验结果表明,Dusp9敲除细胞可以贡献到着床后胎儿和卵黄囊组织中,证明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有多能性。综上所述,我们利用CRISPR-Cas9技术成功获得了Dusp9敲除的ASCs细胞系,Dusp9的缺失会影响胚胎干细胞的DNA甲基化和糖脂代谢等相关基因表达水平。进一步实验证明Dusp9敲除胚胎干细胞系具有干细胞多能性,能够贡献到着床后的胎儿及卵黄囊。