基于功能核酸放大及纳米材料的分子诊疗学新方法研究

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生命科学对人类健康以及现代社会的发展有着举足轻重的影响。随着生命科学的不断向前发展,它与其他学科的结合也日益紧密,促使研究者们在更深入的分子水平上探索各类生物进程,实现对相关疾病的早期诊断以及早期治疗。本论文结合功能核酸放大技术、功能纳米材料及分子成像技术的优势,建立了一些分子诊疗学新方法应用于疾病标志物如三磷酸腺苷(ATP)的检测、外泌体的检测、糖尿病人血糖浓度的检测、不同肿瘤细胞癌症标志物蛋白质络氨酸激酶-7(PTK-7)表达水平的分析及选择性的肿瘤治疗和双模式生物分子成像引导诊疗纳米平台的构建。和传统方法相比,本论文建立的分析检测方法具有操作简便、灵敏度高、特异性高、普适性好等优点,所构建的多功能的纳米平台能有效地实现疾病诊疗。具体研究内容如下:第2章中,该工作描述了一种荧光核酸适配体传感器,它将目标循环链置换放大(TCSDA)和以双链DNA(ds DNA)为模板合成的铜纳米簇(Cu NCs)相结合。具体而言,检测方法是利用目标引起发夹结构变化的设计来检测ATP。核酸适配体发夹探针(AP)与ATP的结合诱导了由发夹结构到打开构型的结构互变。随后促进了AP与引物杂交并触发TCSDA反应。这种放大步骤产生了大量的ds DNA,可以直接作为荧光Cu NCs的合成模板,产生很强的红色荧光信号(激发/发射波长最大值为340 nm/598 nm)用于定量分析ATP。该检测方法的动态范围超过4个数量级(从0.01 n M到100 n M),且检测下限为5 p M。该方法具有普适性,当结合相应的核酸适配体时,这种检测原理可用于其对应分析物的检测。对于生物学和癌症诊疗学来说,能够检测低含量的生物分子或是输送高负载量的药物至靶细胞是必不可少的。第3章中,利用结构互变的核酸适配体在细胞表面触发杂交链式反应,我们发展了一种新型的激活式的诊疗方法,该诊疗方法首次创建了一个能实时激活放大荧光信号用于荧光成像及靶向癌细胞治疗的核酸适配体平台。得益于杂交链式反应,该方法不仅能放大荧光信号用于激活式肿瘤成像,还能富集前药用于选择性肿瘤治疗。体外实验及活细胞研究表明该方法可用于癌症早期诊断及精准的癌症治疗。设计的核酸适配体探针在游离状态不能引发杂交链式反应,当与靶细胞结合之后,因构象互变引发链释放得以引发杂交链式反应。杂交链式反应不仅放大了来自于荧光猝灭探针的荧光信号用于激活式肿瘤成像,而且聚集了来自于标记药物探针的高通量前药,细胞摄入前药并且在细胞内把前药转换成顺铂药物用于选择性的肿瘤治疗。体外实验表明该方法提供了有效的信号放大用于荧光检测靶蛋白PTK-7,检测下限可达1 p M。活细胞研究表明该方法提供了一个高对比度的荧光成像方法及高灵敏检测肿瘤细胞的方法以及一个早期诊断及癌症精准治疗的平台。在第4章中,该工作研究了单链DNA(ss DNA)增强类石墨烯碳化氮(g-C3N4)纳米片内在的过氧化物酶的能力。此工作首次发现了吸附到g-C3N4纳米片表面的ss DNA能够显著提高该纳米片内在的过氧化物酶催化活性。与不修饰的纳米材料相比较,ss DNA-纳米片复合物催化过氧化氢(H2O2)参与的四甲基联苯胺(TMB)氧化的最大反应速率至少是裸纳米片催化最大反应速率的4倍。对其机理研究表明,酶活性的增强可能归因于TMB及ss DNA的静电作用及芳香环堆叠作用。基于核酸适配体与外泌体表面标志物蛋白CD63的相互作用,利用ss DNA-纳米片复合物的强催化活性可以用来高灵敏比色地检测外泌体。该传感器能有效区分不同细胞系如乳腺癌细胞MCF-7及正常细胞系MCF-10A所分泌的外泌体上CD63的含量,并进一步成功应用于乳腺癌病人及健康人血液样品分析。该工作表明ss DNA能增强纳米材料的过氧化物酶活性,ss DNA-纳米片复合物在临床诊断方面的应用上有着巨大潜能。氧化氢氧化钴物(CoOOH)纳米片,一种新兴的二维纳米材料,在分子检测方面显示了巨大的潜力。已经报导的实验中,对这类材料的利用主要是基于他们极强的荧光猝灭和氧化的能力。在第5章中,我们首次报导了CoOOH纳米片的内在的类过氧化物酶活性,并成功应用于葡萄糖检测。实验结果表明,当有H2O2存在时,CoOOH纳米片能加速过氧化物酶底物如TMB转变为有色产物。通过CoOOH纳米片和生物酶葡萄糖氧化酶(GOx)的结合,我们发展了一种简单的比色法用于检测葡萄糖,检测浓度范围在5.3-500μM之间。该方法能有效应用于糖尿病患者血糖浓度的监测,在血糖相关疾病的诊断和治疗方面具有重要的研究意义。建立具有多功能诊疗一体化纳米平台,以减少治疗试剂对正常组织的副作用并增强治疗效率,对于疾病诊断与治疗来说是非常有用的工具。在第6章中,利用氧化还原激活的纳米材料CoOOH纳米片和抗癌药物阿霉素(Dox),我们发展了一个新型的激活式的成像引导诊疗纳米平台。该纳米平台具有磁共振成像/光学成像引导的药物输送及按需药物释放等特点,为成功实现癌症的诊疗提供了一种新的方案。此概念设计能被用于发展更有用的磁共振造影剂,促进了二维多功能纳米材料在生物医学方面的应用。
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