自1981年第一例HIV/AIDS感染病例在美国被报道以来,艾滋病迅速地在全世界范围内蔓延。理论上,HIV感染最好的预防手段是研发艾滋病疫苗。然而,目前仍没有一个艾滋病疫苗被临床试验证明为有效。目前,治疗HIV主要手段是使用各种抗病毒药物。目前临床批准的抗艾滋病药物已经有29种,但绝大部分针对病毒编码的两种酶,即逆转录酶和蛋白酶。尽管有这么多的抗HIV药物,但它们仍然不能清除HIV,只能抑制病毒的复制,将病毒载量降低,定程度地恢复患者的免疫功能,延长患者的生命。直到2003年,第一个HIV进入抑制剂衍生于病毒包膜蛋白gp41的多肽恩夫韦特(T-20)被FDA批准进入临床,开创了病毒进入抑制剂作为抗病毒药物的新时代。HIV进入抑制剂虽然能从源头上阻止病毒的入侵,但其仅能特异性地抑制HIV-1,对HIV-2没有抑制活性,同时多肽类药物价格昂贵,也限制了它们的临床应用。另一棘手的问题是HIV病毒变异性极高,极易产生耐药株,从而使现有的许多抗病毒药物失活。联合3种或4种抗病毒药物(通常包含一种蛋白酶抑制剂)的高活性抗逆转录病毒联合疗法(Highly Active Anti-Retroviral Treatment, HAART)目前已成为治疗HIV感染的标准方法,其可以显著降低HIV感染患者的死亡率和发病率。HAART通常被称为“鸡尾酒疗法”(Cocktail therapy)。不同作用机制的抗病毒药物之间的相互作用及合理搭配使HAART的效果比单一用药有优势,能有效地降低用药剂量,减少不良反应,提高抗病毒谱,更为重要的是能减少耐药病毒株的产生。因此,急需寻找新的来源的药物抑制HIV的广泛传播。人血清白蛋白(HSA)是人血浆中的最为主要的蛋白质,其具有许多重要的生理学和药理学功能,目前已经成为基础及临床研究最广泛的目标蛋白之一。尤其是对HSA进行适当的化学修饰,利用化学修饰产物作为理想的治疗分子进行研发,已经成为生命科学中重要的研究手段之一。HSA其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸,相对分子量为66.5kD,主要是由18种氨基酸残基组成,其中碱性氨基酸赖氨酸有59个,精氨酸则有27个。由于酸酐是强酸性物质,而蛋白质末端含有很多碱性的氨基酸,因此两者发生化学反应时,其蛋白质末端的碱性氨基酸残基必然会被酸酐所修饰。如果将蛋白末端的这些碱性氨基酸,选用适合的酸酐进行化学修饰,将得到一类新的物质,即酸酐修饰的HSA。1995年,美国纽约血液中心的Neurath AR和姜世勃等人的研究发现3-羟基-邻苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalic anhydride,3-HP)修饰的p-乳球蛋白((3-lactoglobulin,β-LG),即3-HP-β-LG,可特异性抑制HIV的感染。未经修饰的β-乳球蛋白及3-HP本身都无抑制HIV的活性,说明酸酐修饰使无活性的蛋白产生了抗HIV活性。然而由于时逢全球疯牛病爆发,使得来源于牛奶蛋白的制剂3HP-β-LG的研发受到了极大的影响,将其研发的试验研究被迫终止。HSA是人血液中最为主要的一种蛋白质,其含量占血浆中总蛋白含量的60%以上,因此含量丰富。而且结构较为稳定,在人血管和血管外循环中分布较广,半衰期长达19d,无明显的免疫原性,是血液中重要的物质输送载体,因此将其做为抗病毒药物研发具有一定的优势。因此,本文采用类似的方法,选用人血清白蛋白作为被修饰蛋白,来研究酸酐修饰人血清白蛋白特性和评价其抗病毒活性及其可能的临床应用。1.酸酐修饰人血清白蛋白HP-HSA的制备和条件优化本文参考文献方法,选用3-羟基-邻苯二甲酸酐HP来修饰人血清白蛋白HSA,为优化HP-HSA的制备条件,我们选用不同浓度的HP (20mM、40mM及60mM)和不同的pH值反应体系(pH7.0、8.0及9.0),合成了的一系列不同的HP-HSA,并评价这些HP-HSA的抗两种HIV-1实验室病毒株(X4及R5型)的活性。同时,我们还通过检测不同条件下合成的HP-HSA期蛋白末端碱性氨基酸(主要包括赖氨酸及精氨酸)残基被HP修饰比率,比较HP-HSA的抗病毒活性与蛋白末端碱性氨基酸被修饰比率之间的相关性。结果发现,HSA蛋白末端的碱性氨基酸残基大部分能被HP所修饰,其蛋白的化学结构发生了变化,从而将无活性的HSA转变成具有较强抗HIV-1活性的病毒抑制剂HP-HSA。HP-HSA中赖氨酸和精氨酸残基的被修饰的比率越高,其抗抗HIV-1X4型(HIV-1ⅢB)及R5型(HIV-1Bal)的病毒株的作用也相应的越强,说明蛋白末端碱性氨基酸被修饰的比率与HP-HSA抗病毒活性密切呈正相关,修饰蛋白末端的碱性氨基酸残基被相应酸酐修饰的比率与酸酐修饰蛋白的抗病毒活性密切相关。通过比较分析确定,HP-HSA化学修饰的最优合成条件为,酸酐HP终浓度60mM,pH值为9.0,在这一条件下,HP-HSA的蛋白末端赖氨酸被修饰的比率为98.17%,而精氨酸被修饰的比率为91.67%。而在这一条件下,合成的HP-HSA的抗HIV-1IIIB(X4型)和BaL(R5型)病毒的IC50值分别是0.851nM和1.454nM。2. HP-HSA抗病毒活性研究作为一个理想的防治性传播性疾病的抗病毒制剂,首先要保证其具有广谱性和有效性,即能够高效抑制绝大部分与性传播疾病有关的病原体的感染。与3HP-β-LG相类似,酸酐修饰蛋白HP-HSA也具有广谱高效的抗病毒活性,其能抑制多种HIV-1实验室病毒株包括HIV-1X4型和R5型,IC50在低纳摩尔水平。另外,HP-HSA也能有效抑制HIV-2感染,意味着HP-HSA也能被用于HIV-2病毒广泛流行的西非等国家。同时HP-HSA还能抑制SIV的感染[4]。由于SIV病毒能够感染恒河猴,因此利用SIV病毒阴道攻击恒河猴的动物模型,可先期评价HP-HSA在动物体内的抗病毒活性。目前大多数的抗病毒药物,尤其是临床上应用最为广泛的逆转录酶抑制剂临床应用的局限性最主要的是由于HIV病毒耐药株的产生。HIV病毒需寄生于宿主细胞内,利用宿主细胞的代谢系统生存、增殖,并保持极强的生命力。HIV病毒在宿主细胞内不断复制,但是其复制的错配率极高且极易产生高变异性,这也是目前理想抗HIV病毒药物研发缓慢的主要原因之一。本文研究发现,HP-HSA对几类常见的抗病毒药物包括核苷类逆转录酶抑制剂AZT,非核苷逆转录酶抑制剂A17及HIV进入抑制剂T20的耐药病毒株,均具有非常好的抑制作用,其IC50值均在低纳摩尔水平,与抗HIV-1实验室病毒分离株的抗性相当。这弥补了这些目前临床应用的主要的抗病毒药物的不足,从而使其具备了被进一步开发的前景。如果将这类蛋白类药物与抗病毒药物联合应用,可能也将成为抗病毒药物研究的一个新的方向。如前所述,生殖器单纯疱疹病毒II型(Herpes Simplex Virus, HSV-2)是另一类导致性传播性疾病STD的主要病原体,约75%生殖器疱疹病例是由HSV-2引起的,它是引发生殖器疱疹和溃疡最主要的原因,是一个世界性的公共卫生问题。值得注意的是,其引发的生殖器疱疹据报道与HIV感染的关系极为密切,研究发现患有生殖器疱疹的病人更容易感染HIV,其HIV感染率可增加2-4倍。因此,有效控制HSV-2感染对减少HIV的流行具有直接的作用。如果抗病毒药物在具有抗HIV活性的同时,具有抑制HSV-2病毒的作用,则将大大增加该抗病毒药物的抗HIV活性,从而成为高效双功能的抗病毒制剂。目前,临床应用的大部分抗HIV药物均为窄谱抗病毒药物,其无或者对HSV-2的抑制作用不强。本文我们研究发现,酸酐修饰人血清白蛋白HP-HSA对HSV-2病毒有明显抑制作用。3. HP-HSA抗病毒作用机制研究HIV病毒进入CD+4靶细胞一般是在1h内完成的。如果一种药物为HIV进入抑制剂,其必须在病毒进入靶细胞前与病毒或靶细胞接触。因此,我们选用time-of-addition的分析方式,在病毒感染靶细胞的不同阶段加入酸酐修饰蛋白,以观察HP-HSA到底作用在HIV感染的哪个环节。实验结果发现,当HP-HSA在病毒感染2h后加入时,其抗HIV-lHIB和抗HIV-1BaL病毒活性完全消失,其作用与FDA批准的三种HIV进入抑制剂如T20,AMD3100(CXCR4辅助受体抑制剂)及Maraviric (CCR5辅助受体抑制剂)药物的失活时间相似,而对照药物逆转录酶抑制剂AZT,即使在病毒感染靶细胞8h后加入,仍然能保持较高的抗HIV-1活性。这些结果说明HP-HSA是一类特异性的HIV进入抑制剂,对HIV病毒复制的其他环节无明显作用。由于阻断HIV病毒生命周期的第一个阶段,因此靶向HIV进入阶段的抗病毒药物均具有明显的优势。研究表明,游离病毒和已感染HIV的靶细胞都能感染新的靶细胞,而后者在HIV的感染中占主要地位。在HIV的感染过程中,首先是HIV包膜与靶细胞膜发生融合,HIV基因组进入靶细胞。HIV进入靶细胞是由病毒表面的包膜糖蛋白介导的。因此,阻止HIV病毒的进入,关键是阻止HIV Env诱导的细胞-细胞融合及病毒-细胞融合过程。通过细胞-细胞融合、病毒-细胞融合及细胞间的传播等实验结果分析可知,HP-HSA的确作用于病毒的进入阶段,是一类HIV进入／融合抑制剂。HIV通过三个步骤进入宿主细胞：1)HIV颗粒通过其包膜上的糖蛋白gp120与靶细胞表面的CD4受体粘附；2)gp120发生构象改变以适应与靶细胞上的辅助受体CCR5或CXCR4结合；3)HIV跨膜蛋白亚基gp41介导病毒包膜与靶细胞膜发生融合。那么HP-HSA到底作用于HIV进入的哪个环节,则成了我们下一步关心的问题,因此我们对HP-HSA的作用靶点进行研究。HIV进入靶细胞的第一步就是HIV病毒颗粒通过其包膜糖蛋白gp120与靶细胞表面的CD4受体粘附,因此,我们首先检测HP-HSA是否抑制gp120和可溶性CD4分子(sCD4)的体外结合。结果发现,HP-HSA能抑制来源于HIV-1HIB和HIV-1BaL的gp120与sCD4的结合,而未修饰HSA则无抑制作用。这些结果表明,HP-HSA可能是通过抑制病毒包膜糖蛋白gp120结合到靶细胞上的CD4受体而产生抑制作用的。ELISA和流式分析结果进一步表明,HP-HSA可通过与病毒包膜糖蛋白gp120和靶细胞上的CD4受体结合,阻止HIV-1的gp120与CD4两者的相互作用,从而产生抑制病毒与细胞膜融合的过程。HSA蛋白表面正电荷的精氨酸和赖氨酸残基被酸酐修饰之后,其表面聚集着大量的负电荷侧链,这些负电荷侧链能与gp120和CD4分子结合,从而产生抗病毒作用。4. HP-HSA的局部用药安全性研究理想的抗病毒药物除了具备上述价廉和高效等条件外,更为重要的一点即为其安全性。抗病毒药物由于可能每日被多次使用,且长期甚至终生服用,因此必须不会导致组织损伤,不会产生过敏反应,不会改变阴道内酸性环境,不会造成阴道内菌群失调,同时,应无全身性毒副反应。在体液中仍能保持较好的抗病毒活性。阴道粘膜是多层鳞状上皮细胞,它们组成了防御外来病毒的一道物理屏障。因此,任何能破坏上皮组织完整性的因素,譬如物理损伤、性传播病原体的感染、局部溃疡及炎症、激素水平失衡、阴道正常菌群失调、以及不当使用阴道洗液等,都可能提高HIV的感染率。因此,药物对阴道上皮细胞的毒性是其能否用于临床的关键。我们首先评价了HP-HSA对3种T淋巴细胞和3种正常人阴道及子宫颈上皮细胞的体外毒性,结果显示,HP-HSA对测试的6种病毒作用T淋巴靶细胞及正常人阴道及子宫颈组织细胞的细胞毒性作用很低,其CC50的值远远大于其抑制HIV-1HIB病毒的IC50值,这意味着HP-HSA体外基本无毒。阴道乳酸菌是内源性的杀微生物剂,它能通过产生乳酸和过氧化氢来发挥效能。流行病学研究表明产过氧化氢乳酸菌能有效降低HIV的感染率。其原因推测是间接的,产过氧化氢乳酸菌能降低细菌性阴道炎的发病率,而后者导致的阴道上皮组织损伤是HIV传染的一个主要影响因素。因此,我们评估了HP-HSA对17株正常人阴道乳酸杆菌生长的影响。药敏实验结果发现,较高浓度的HP-HSA对阴道正常乳酸杆菌的生长无明显影响,而阳性对照药物氨苄青霉素对阴道乳酸杆菌各株均有明显抑制作用,其MIC为0.313～1.25前面研究证实,HP-HSA的作用靶点之一为T淋巴细胞表面的CD4受体,而CD4+T淋巴细胞是人免疫系统中极为重要的一类细胞,对人正常免疫功能起着至关重要的作用[8]。那么,HP-HSA作为杀微生物剂用于机体后,是否会对T淋巴细胞的正常的功能产生影响?首先,我们观察了HP-HSA是否对正常人PBMCs增殖的影响,同时观察了HP-HSA对PHA刺激的PBMCs增殖的反应,结果证明即使在浓度为100μM时,HP-HSA对正常和PHA刺激的PBMCs的生长增殖均无明显的影响。随后,我们评估了HP-HSA对正常和PHA刺激的PBMCs分泌细胞因子IFN-γ功能的影响,结果同样证明HP-HSA对正常和PHA刺激PBMCs的免疫功能无影响。这些结果初步证明,HP-HSA对CD4+T细胞的功能,尤其是处于体内循环状态的T细胞不会产生有害的影响。但是,我们也不能排除长期应用阻断CD4受体的杀微生物剂可能会抑制阴道粘膜中的CD4+T细胞的免疫功能,这也正是我们下一步准备进行的安全性实验,评估HP-HSA对家兔阴道粘膜免疫系统的影响。性传播是目前HIV传播的主要途径,因此人体精液和宫颈阴道液对抗HIV药物活性影响的评估就显得至关重要了。一般来说,理想的抗病毒药物还应该在存在大量体液时,仍能保持较强的抗病毒活性。有文献报道,精液的存在会降低一些候选杀微生物剂的活性。本文结果可见,人体正常精液和阴道模拟液对HP-HSA的抗病毒活性并无显著影响。(五)小结HP-HSA为水溶性蛋白,其无味,高浓度是呈淡黄色,制备简单、快速、可重现,且其体外毒性、免疫功能和稳定性评估证明其安全稳定,具有被开发成抗病毒药物的潜能。HP-HSA的优势：1)具广谱抗病毒活性,能对抗HIV-1,HIV-2, SIV和HSV的感染；2)能有效对抗各类药物的耐受株,包括核苷逆转录酶抑制剂耐药株、非核苷逆转录酶抑制剂耐药株及T20耐药株；3)HP-HSA为来源于人的大分子蛋白类药物,其生物半衰期长；4)HSA来源于人类,其抗原性较低,不易诱导不利的免疫反应。然而,HP-HSA作为蛋白类药物可能存在价格较高、给药方式较难选择等缺陷。将两类不同作用机制或不同作用靶点的新型抗病毒药物与临床应用的抗病毒药物联合应用,将有效避免各自的优缺点,取长补短,发挥各自的优势,从而产生协同作用效果。