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第一部分吸烟对肺的损伤作用及claudin蛋白表达的影响目的本实验通过建立大鼠吸烟模型和细胞吸烟模型,旨在研究claudin在吸烟所致肺损伤中的表达变化情况及可能意义。方法实验选用SPF级SD大鼠,随机分为对照组和吸烟组。烟雾被动吸入法,每次烟熏20支,20-30分钟,共吸烟3个月。腹腔放血处死后,收集肺组织标本,行肺泡灌洗术,检测肺泡灌洗液炎症因子;HE和PAS染色光镜下观察肺组织病理改变和计算PAS阳性面积比率,以评价造模后肺组织损伤情况。检测肺组织mRNA水平claudin-1、-3、-4、-7表达。细胞实验选用16HBE人支气管上皮细胞系,配制香烟烟雾提取物(CSE),设立对照组、5%、10%、20%CSE组,处理2天,检测细胞claudin-1、claudin-4蛋白表达情况。以观察吸烟所致肺损伤中claudin表达变化情况。结果吸烟组大鼠抵抗力下降,体重减轻。光镜下组织有明显病理改变,气道上皮见坏死脱落细胞,纤毛结构消失,上皮层内淋巴细胞增多。同时吸烟组气道PAS染色阳性率增加。吸烟组大鼠肺泡灌洗液炎症因子TNF-a,IL-8明显上升,组织claudin-1、4mRNA表达显著下降,而claudin-3、claudin-7mRNA表达没有明显变化。吸烟的细胞模型中,5%、10%、20%CSE处理的气道上皮细胞claudin-1蛋白显著下降,claudin-4蛋白显著上升。并且均随着CSE浓度梯度上升而变化加大。结论1、大鼠烟熏造模后,气道出现如COPD样改变的病理生理变化,肺泡灌洗液炎症因子增加。2、claudin-1、claudin-4mRNA在吸烟大鼠肺组织中表达明显下降,可能是肺上皮屏障功能下降的原因。3、短期细胞吸烟模型中,claudin-1蛋白保持下降不变,表明短期吸烟即可影响气道细胞claudin蛋白的表达。claudin-4蛋白反跳性上升,可能是细胞面对上皮屏障损害的保护性作用之一。第二部分角质细胞生长因子-2对吸烟引起肺损伤保护性作用的研究目的 本实验通过建立支气管上皮细胞吸烟模型,观察KGF-2对吸烟引起的支气管上皮细胞保护性作用及claudin蛋白表达的变化,为KGF-2临床运用于肺损伤奠定基础。方法实验选用16HBE人支气管上皮细胞系,配制香烟烟雾提取物(CSE)。MTT法检测10% CSE+KGF-2组与10%CSE组细胞活性差别。PI染色法分析P组、K组,10% CSE+KGF-2组与10%CSE组凋亡期、G0/G1期、S+G2/M期细胞所占百分比。运用流式细胞计数检测P组、K组、10%CSE+KGF-2组与10%CSE组处理后的增殖细胞数目,并用western blot法检测磷酸化Akt蛋白表达情况。在transwell板上利用电阻仪检测P组、K组、20%CSE组细胞与20%CSE+KGF-2组细胞经上皮电阻抗(TEER),并用western blot法检测各组细胞claudin-1、-4蛋白表达的变化情况。结果MTT显示KGF-2+10%CSE组的细胞活性率显著高于10%CSE组。利用周期分析得10%CSE+KGF-2组与10%CSE组相比凋亡率有所减少,G0/Gl期细胞比率下降,S+G2/M期细胞比率上升。流式细胞检测KGF-2给药组的细胞增殖数目显著高于非给药组,且CSE刺激下,此效果有叠加作用,可见KGF-2可以增加细胞的活性,增殖率。10%CSE+KGF-2组的磷酸化AKt蛋白表达量显著高于10%CSE组,提示KGF-2作用通路可能通过P13K/Akt信号传导通路。20%CSE+KGF-2组TEER显著高于20%KGF-2组,说明KGF-2对吸烟引起的上皮屏障功能减弱也存在作用。给药组与非给药组细胞claudin-1、-4蛋白无显著变化,提示K6F-2对上皮屏障功能的保护作用机制并非通过claudin蛋白。结论1、KGF-2提高气道上皮细胞的增殖力,使处于分裂期的细胞数目增加。2、KGF-2可增强气道上皮屏障功能,抵御熏烟带来的损害。3、KGF-2增加气道上皮屏障功能并非通过调节claudin蛋白而产生。