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背景和目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常见白血病类型,随年龄增长发病率逐渐增高,是中老年人群的主要恶性疾病。其中,40%~50%AML患者在治疗过程中疾病出现复发,最终导致死亡,如何提高复发难治AML疗效是临床急需解决的问题。针对AML复发的研究目前主要集中在AML细胞和AML白血病干细胞(leukemic stem cells,LSCs)。事实上,AML LSCs并非孤立存在,其生物学特点与其所在骨髓造血微环境的功能异常息息相关,国内外研究显示白血病异常造血微环境具有维持AML-LSCs干性的作用。我们在前期预实验中发现:在AML患者骨髓活检片中发现大量CD68呈强阳性表达的细胞,这些细胞与白血病细胞混合存在;在正常人骨髓活检中仅能看到少量CD68阳性细胞。CD68是巨噬细胞表面标记,AML患者骨髓活检中大量巨噬细胞源于何处,对白血病发生发展产生什么样的作用,值得进一步探索。近年,实体肿瘤领域研究发现,肿瘤组织中有大量巨噬细胞,这些巨噬细胞被称作肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAMs),其在促进肿瘤细胞增殖侵袭、新生血管形成以及产生免疫抑制等方面发挥重要作用,成为肿瘤微环境研究的热点问题。虽然TAMs在血液肿瘤领域的研究仍处于起步阶段,但是现有研究已经显示TAMs在血液肿瘤发生发展中的重要作用。巨噬细胞来源于髓系单核细胞,AML患者髓系干细胞恶性变,我们推测AML微环境中大量巨噬细胞可能来源于恶性变的AML LSCs。本研究拟分选AML LSCs,在巨噬细胞条件培养基中培养,获得AML LSCs源性巨噬样细胞,深入探讨AML LSCs源性巨噬样细胞生物学特性,为全面认识AML LSCs源性巨噬样细胞在AML异常微环境形成中的作用提供理论依据,也为难治复发AML新型治疗模式的探索提供可行的设计思路。方法:1.用流式细胞技术分选AML细胞系Kasumi-3和原代AML骨髓标本中CD34~+CD38~-CD123~+AML LSCs,置于含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养1周,之后转入含有IL-4、TGF-β的培养基中继续培养,获得AML LSCs源性巨噬样细胞;透射电镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞超微结构变化;激光共聚焦显微镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞表面标记表达情况;选择有AML1/ETO融合基因AML患者骨髓标本进行分选培养获得AML LSCs源性巨噬样细胞,分别检测AML LSCs、AML LSCs-源性巨噬样细胞AML1/ETO表达情况;2.ELISA检测AML LSCs源性巨噬样细胞培养上清IL-10和IL-13水平;细菌吞噬试验验证AML LSCs源性巨噬样细胞生物学功能;检测与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养后,Kasumi-3细胞表面耐药蛋白ABC表达情况;不同培养条件下测定Kasumi-3细胞对多种化疗药物耐药系数的变化及不同培养条件下Kasumi-3细胞对DNR的摄药量;3.通过调取GEO(Gene Expression Omnibus)、TCGA(The Cancer Genome Atlas)等数据库数据,寻找分析AML LSCs源性巨噬样细胞参与肿瘤发生发展过程中起着重要重用的调控基因群,进一步分析这群基因与AML预后的相关性,从而找出参与AML调控的关键基因,分析这些基因的表达情况及其下游调控网络和信号通路。结果:1.培养获得的AML LSCs源性巨噬样细胞呈多形性,以多角形和椭圆形贴壁细胞为主,透射电镜发现细胞呈椭圆形,胞浆丰富,有较多空泡;近胞核处高尔基体富集;包膜绒毛丰富且较长。细胞特异性表达CD11b、CD163、CD206;以AML1/ETO为标记,证明AML LSCs源性巨噬样细胞与AML LSCs细胞具有同源性,均检测到不同水平AML1/ETO融合基因表达;2.ELISA检测AML LSCs源性巨噬样细胞培养上清细胞因子水平:IL-10分泌高峰在培养第8天,分泌量为12.2pg/ml,IL-13的分泌高峰在第10天,分泌量为14.1pg/ml;细菌吞噬试验证明其可吞噬大量呈绿色杆状荧光的E.coli菌,随着孵育时间的延长,吞噬数量逐渐增多;3.激光共聚焦显微镜观察发现与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞表面ABC转运蛋白表达明显强于对照组,对柔红霉素(DNR)摄药量低于悬浮培养Kasumi-3细胞(54.75±4.28 vs.93.84±3.93)(P<0.01),对阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-C)和足叶乙甙(VP-16)均有一定的耐药性。4.通过对GEO数据库检索、GEO2R分析和TCGA数据库的在线分析,得到34个基因与AML预后显著相关基因;通过基因表达量、其他AML数据库分析及文献阅读,最终确定GREM1基因为LAMs参与白血病调控的关键因子;进一步进行互作基因的GO分析,确定GREM1通过影响线粒体能量代谢阻抑白血病细胞凋亡,参与AML发生。结论:1.AML LSCs可以在适当条件下分化成AML LSCs源性巨噬样细胞;2.AML LSCs源性巨噬样细胞具有与经典骨髓M2型巨噬细胞相似生物学特性;3.AML LSCs源性巨噬样细胞促进AML细胞耐药蛋白表达,介导白血病细胞耐药;4.GREM1基因可能是AML LSCs源性巨噬样细胞调控AML发生发展的关键基因,GREM1通过影响线粒体能量代谢阻抑白血病细胞凋亡参与AML发生。