恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命与健康的一类疾病。p53作为重要的肿瘤抑制基因,通过调控细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和DNA损伤修复等信号通路维持细胞稳态,抑制肿瘤发生。在人类自发肿瘤中,其突变频率高达50%。与其他大部分的抑癌基因突变时发生基因截短或缺失不同,p53突变主要是点突变,97%的p53突变都集中发生在DNA结合区,其中75%以上突变为错义突变。大多数情况下,p53发生突变后,不仅丧失野生型p53的功能,即功能缺失(Loss of Function, LOF),同时还能够获得癌基因活性,促进肿瘤的发生发展,即功能获得(Gain of Function, GOF)。突变p53功能获得后的生物学表型很多,其中包括加剧基因组的不稳定性,促进细胞的迁移和侵袭以及使细胞获得药物耐受抗凋亡特性等等。此外,不同位点的p53突变或者同一位点的不同p53突变亚型造成的获得性表型有所不同。因此,针对不同的突变p53功能获得和功能缺失的研究,将有助于我们更清晰的了解突变p53促进肿瘤发生发展的机制。研究突变p53的促进肿瘤发生发展机制过程中,主要是以突变p53的六个热点突变,包括R175H、G245S、R248Q、R249S和R273H以及R282W,作为研究对象。2016年,Matthew T Chang等人针对人类肿瘤中抑癌基因p53的热点突变分析确定了p53的多个热点突变,其中包括N239S(在小鼠中为N236S)。在本实验室的前期对携带p53N236S(在人类中为p53N239S,以下简称p53S)突变的MEF(Mouse Embryonic Fibroblast)细胞研究中发现,p53S不仅在应激电离辐射刺激下丧失了野生型p53对下游靶基因(如p21、cyclinG等)的转录调控能力,而且还获得了癌基因的潜能,能够与Ras突变(H-rasG12V)协同,加速肿瘤的发生发展进程。同时,使用广谱的抗肿瘤药物阿霉素(Doxorubicin)处理后,p53S相关细胞表现出对药物的耐受性,而Ras的稳定表达能够加强这种耐药性。阿霉素是一种蒽环类DNA损伤药物,可嵌入到DNA相邻碱基之间,产生活性自由基,促使DNA双螺旋解旋,DNA断裂,同时也能够抑制拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ以及RNA聚合酶活性,干扰DNA复制和RNA转录过程,最终导致细胞死亡。因此,本研究以p53S为研究对象,验证p53S细胞对阿霉素处理耐受,并初步探索p53S对阿霉素的耐药机制。首先,我们使用阿霉素剂量时间梯度分别处理WT细胞(p53为野生型的MEF细胞)、p53s/s+v细胞(在p53s/s MEF细胞中转染pBABE空载体)、p53s/s+Ras(在p53s/s MEF细胞中转染了H-rasG12V-pBABE载体,使Ras能够稳定表达),通过常规的药物筛选方法(MTT、SRB)检测阿霉素对这三种细胞的细胞毒性,结果显示,p53S细胞(p53s/s+v)较WT细胞并不具有更高的IC5o值,提示依据IC5o值的大小并不能判断出p53S细胞对阿霉素处理耐受。但是生长曲线图显示,WT细胞应激阿霉素处理时随着阿霉素处理浓度的升高,细胞生长速率呈下降趋势,此时,相同处理条件下p53S细胞仍处于快速增殖的状态,提示p53S细胞对阿霉素处理具有一定的耐受性。随后我们使用0.5μg/mL的阿霉素浓度处理这三种细胞,分别作用12h和24h,通过Western Blot和流式细胞术检测凋亡情况,实验结果则显示相同条件处理下p53S细胞的凋亡相关蛋白(caspase3和PARP)表达量和细胞凋亡百分比都较WT细胞低,提示p53S细胞可以通过抑制凋亡通路来实现对阿霉素处理的耐受。另外,生长曲线图显示,p53s/s+Ras细胞的生长速率明显高于p53s/s+v细胞,且流式检测的p53s/s+Ras细胞应激阿霉素处理的凋亡百分比也要明显低于p53s/s+v细胞(9.6%VS 28.3%)。这提示Ras的稳定表达协同p53S增强细胞对阿霉素诱导凋亡的耐受能力。出乎预料的是,我们引入p53敲除(p53-/-)的MEF细胞进行实验时,Western Blot和流式细胞术检测的凋亡情况显示,在使用阿霉素相同条件处理下,p53-／-MEF细胞对阿霉素诱导凋亡同样具有耐受性,提示p53S细胞对阿霉素诱导的凋亡耐受可能主要归因于p53突变的功能缺失。然而,细胞的耐药机制,除了抗凋亡以外,还有很多,如增强DNA损伤修复能力,增加药物外排功能等等。而我们的实验数据也显示,在阿霉素浓度梯度处理后,与p53-/-细胞比较,p53S细胞中DNA损伤标志蛋白γ-H2AX的含量降低得更快,提示p53S可能同时通过增加DNA损伤修复来实现细胞耐药。脉冲场电泳实验中检测的DNA损伤情况也证明了,p53-/-细胞的DNA修复能力弱于p53s/s+v细胞。同时,流式检测的凋亡数据显示,给予一定的修复时间,p53-/-细胞与P53s/s+v细胞相比较对阿霉素诱导的凋亡更敏感。这些数据提示我们,p53S细胞可能是通过抑制凋亡通路的同时增加DNA损伤修复来抵抗阿霉素诱导的凋亡和DNA损伤。为了进一步探讨p53S细胞耐受阿霉素诱导凋亡的抗凋亡机制,我们依据ChIP-on-chip的芯片数据分析受p53S调控的下游靶基因,并通过功能富集分析筛选出受p53S特定调控的与凋亡相关的靶基因Apaf1和Birc5(又名survivin)等。Apaf1编码蛋白可促进凋亡发生,Birc5编码蛋白是凋亡抑制蛋白家族IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins)家族成员。为验证p53S可以转录调控Apaf1和Birc5基因,我们进行了染色质免疫共沉淀实验(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)、Western Blot及Realtime-PCR实验。ChIP实验结果表明p53S能够结合于Apaf1和survivin的启动子区域,Western Blot和Realtime-PCR检测结果显示,p53S细胞中Apaf1的转录水平和蛋白水平都下调,而survivin则都上调,线粒体凋亡通路中相关的凋亡起始者caspase9以及凋亡执行者caspase3和caspase7都下调,提示p53S可能通过结合Apaf1和Birc5基因启动子区域对其进行转录调控,进而干扰细胞内源凋亡信号通路。进一步,我们采用siRNA干扰技术降低survivin的表达水平,以研究survivin表达水平对p53S细胞耐药性的影响。结果发现,survivin表达降低能够显著提高p53S细胞系对阿霉素处理的敏感性。但是这种增敏作用并没有促使p53S细胞回复至野生型细胞对阿霉素处理的敏感程度。此外,流式检测的细胞凋亡情况显示,降低survivin表达量后,p53s/s+Ras细胞应激阿霉素诱导的凋亡率仍要低于p53s/s+v细胞。这提示Ras的稳定表达,同survivin一样,也贡献于细胞对阿霉素处理的耐药性。综上所述,本论文研究发现,p53S突变能够促使细胞对阿霉素具有药物耐受性,并且证实,p53S细胞对阿霉素的耐药性是通过抑制凋亡通路的同时增强DNA损伤修复来实现的。另外,通过对这种耐药抗凋亡机制的研究显示,抗凋亡蛋白survivin的表达量降低可以增加p53S细胞对阿霉素处理的敏感度,提示p53S调控的survivin高表达促进了细胞对阿霉素诱导凋亡的耐受性。此外,p53S除了可以通过抗凋亡机制引起细胞对阿霉素处理耐受外,还可能通过增强细胞DNA损伤修复促进细胞存活。以上研究成果将为临床上p53突变作为药物治疗靶标的用药策略提供一定的理论基础。