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启动子是基因表达调控的最基本、也是最重要的元件之一,是基因在生物体内表达的“开关"。对启动子区域中增强子等顺式元件与各类转录因子(主要是特异转录因子)的相互作用研究,是理解基因表达调控机制的重要内容。
脂联素(adiponectin,APM)是目前研究的较为热门的特异的脂源性细胞因子之一,它调控生物体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢,是至今发现的唯一与肥胖呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白。有研究表明该基因与动物脂肪沉积相关,但是有关猪脂联素基因启动子及其表达调控机制尚无相关报道。
肌球蛋白轻链1基因(MLC1f/3f)的转录调控受一系列的调控元件控制,包括MLC1f和MLC3f的启动子元件和两个不同的肌肉组织特异增强子元件。已有研究表明,肌球蛋白轻链1基因编码的不同剪切体(主要是MLC1f/3f)与哺乳动物骨骼肌肌纤维类型相关。本课题组蔡更元(2006)与方伟(2007)初步分析了猪Myl1基因的选择性剪接体的特征及其在不同猪种以及组织中的表达。
在已有研究基础上,本研究通过猪BAC文库筛选,焦磷酸测序,获得了这两个基因5侧翼序列。在此基础上,运用5-RACE、3-RACE技术、启动子甲基化特异性PCR分析、RT-PCR、Realtime-PCR、Northern blot、启动子双报告基因瞬时转染实验、EMSA(凝胶阻滞分析)及SNP筛查等方法,鉴定、分析了这两个基因的启动子以及其他重要顺式元件,从DNA水平(甲基化)、转录水平(启动子)、转录后的修饰水平(选择性剪切)几个不同表达调控水平,研究了脂联素基因与肌球蛋白轻链1基因,在蓝塘与长白猪不同组织的时空表达特征及其可能遗传机制,为进一步揭示这些基因的表达调控规律奠定基础。本研究的主要结果如下:
脂联素基因:
1、首次获得猪脂联素基因1871bp 5侧翼序列,5-RACE首次发现该基因存在3个不同转录起始位点。
2、RT-PCR表明猪脂联素基因只在胰脏、大肠、小肠、背肌及脂肪中表达。
3、实时荧光定量PCR揭示了脂联素基因在蓝塘与长白猪骨骼肌与脂肪细胞的表达规律:1)骨骼肌中,adiponectin基因在蓝塘猪刚出生时表达量最高,成年期表达量最低;而长白猪在90日龄时表达量最低,180日龄时表达量最高;2)脂肪组织中,adiponectin基因在整个个体发育时期的不同猪种的表达规律几乎是一致的:adiponectin基因表达量先缓慢上调,90日龄时表达量同时达到最高,而在成年期同时相对几乎无表达。
4、启动子活性分析表明脂联素基因启动子区域内的-1671~-1455bp之间可能有一个增强子在起作用,该增强子为cAMP应答元件结合蛋白的结合位点CRE,EMSA实验鉴定该增强子对脂联素基因活性具有重要的作用。
5、启动子甲基化分析表明脂联素基因在肌肉组织中的甲基化状态与该基因在不同猪种肌肉组织中表达量的波动趋势基本一致,甲基化与去甲基化过程主要发生在某些特定的CpG位点。
6、SNP筛查发现脂联素基因启动子区多态不丰富,2个SNP形成了2个PCR-RFLP标记。
肌球蛋白轻链1基因:
1、首次获得猪肌球蛋白轻链1基因的5’侧翼序列。
2、5’-RACE与3’-RACE首次揭示了猪肌球蛋白轻链1基因存在3种不同的转录起始位点,鉴定了该基因存在2种不同的转录终止形式并且获得了Myl1各转录本(MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)的cDNA全长。
3、RT-PCR结合Northern blot结果表明,肌球蛋白轻链1基因的2种新选择性剪切体(MLC5f-B和MLC5f-C)仅在猪背最长肌(骨骼肌)中表达,MLC1f和MLC3f可能是肌肉组织(心肌和背最长肌)发育所必需的,而MLC5f可能主要与骨骼肌的发育有关。
4、实时荧光定量PCR结果表明,剪切体MLC3f在180日龄长白猪中的表达量最高,而剪切体MLC1f则是在90日龄蓝塘猪的表达量最高:剪切体MLC5f-A在蓝塘与长白猪中各发育时期的表达量都很低;除了剪切体MLC1f外,其余转录本的表达量都是随着个体体重的增加而逐步增加。
5、启动子活性分析表明,肌球蛋白轻链1基因具有两个选择性启动子,启动子1的-1400~-1132bp区域内与启动子2的-520~-326bp区域内可能分别存在一个重要的增强子。EMSA实验首次鉴定到一个新的具有极低活性的肌细胞增强因子3(MEF3),该增强子需要某些诱导因子的激活。
6、SNP筛查发现肌球蛋白轻链1基因的启动子区多态不丰富,2个SNP只形成了1个PCR-RFLP标记。
结合前人研究结果,本研究认为,这两个基因在肌肉组织中应当属于2个相对独立的基因调控表达系统,脂联素基因可能是影响猪脂肪沉积的一个重要候选基因;肌球蛋白轻链1基因则可能影响不同猪种特定肌肉纤维形成的另一个重要候选基因。