背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的,以关节滑膜炎症为特征的自身免疫性疾病,其病理主要特点是滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、衬里层增厚、血管翳形成,继而引起软骨和骨组织的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失。临床表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降,病变呈持续、反复过程。RA发病呈全球分布,在我国的发病率为0.26～0.5%,可发生于任何年龄,随着年龄增加发病率也逐步增加。一般女性多发,发病高峰在45-50岁之间。RA病程缠绵、反复,致残率高,几乎所有的RA患者都有不同程度的关节功能丧失,由此带来严重的社会问题和经济负担。RA的发病机制复杂,其中有多种免疫细胞和细胞因子的参与,其主要病理学特点为滑膜细胞增生,聚集大量的炎细胞,如T细胞、浆细胞和巨噬细胞等,衬里层增厚,最终形成血管翳,滑膜组织过度增生和血管翳直接侵蚀关节软骨破坏及关节软骨下的骨组织。RA滑膜组织最主要的组成成分是成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS),其起源于间质细胞,除参与关节软骨降解及骨侵蚀外,还分泌多种前炎症因子和蛋白,包括IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、转化生长因子(TGF)-β、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等,间接参与骨破坏进程,是关节炎症和组织破坏的直接效应者,在RA的发生、发展中起重要作用。RA患者为Thl及其细胞因子占优势,促炎因子TNF-α、IL-1及血管新生相关因子VEGF、MMPs在RA患者血清中明显升高。Youn等检测到RA患者血清和关节液中TNF-a含量明显高于骨关节炎(osteoarthritis, OA)患者及正常人。采用可溶性TNF-a受体融合蛋白或单克隆抗体阻断TNF-α,可有效减轻RA患者疾病活动度,控制骨破坏。在对体外培养的RA-FLS的研究也发现,阻断TNF-α可以在一定程度上控制滑膜细胞炎症反应。RA活化的炎症细胞在分泌大量炎症因子的同时,还分泌大量的MMPs,且RA的血管新生除了与VEGF有关外,尚与MMPs生物学活性密切相关。MMPs是一类活性依赖于金属锌离子的蛋白酶,它以酶原形式分泌,经激活后参与胶原等细胞外基质的降解而影响血管生成。IL-10是一种天然的免疫抑制剂,它能有效的抑制T细胞和抗原呈递细胞,抑制TNF-α、IL-1的释放及MMPs的产生,促进针对TNF-α、IL-1的受体产生,从而发挥对软骨及骨细胞的保护作用。RA属于祖国传统医学“痹证”范畴。痹证的发生主要是由于正气不足,感受风、寒、湿、热之邪所致。内因是基础,素体虚弱、正气不足、腠理不密、卫外不固,是引起痹证的内在因素,如再感受外邪,使肌肉、关节、经络痹阻而形成痹证。从以上病机特点看来,治疗本病当以祛风散寒除湿,益气活血通络为大法。小乌桂汤由《千金要方》小续命汤、《金匮要略》乌头汤和桂枝芍药知母汤组成,是全国名老中医陈宝田教授研制的,我科临床应用30余年,大量病例证实有良好疗效的经验方,其功效为疏风散寒、祛湿益气、养血通络。方中以麻黄、桂枝、干姜、防风、附子、川乌祛风散寒除湿；以当归、川芎、丹皮活血通络；以党参、黄芪、当归、白芍扶正益气养血；石膏、知母用寒凉之品,以防麻黄、桂枝、干姜、川乌等辛温过度耗伤正气。从现代医学角度来看,本方具有消炎、镇痛、调节免疫之功能。目前在临床上用于RA治疗,并取得了肯定的疗效,但其具体作用机制尚未清楚。甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)是一种细胞毒药物,可抑制体液免疫和细胞免疫,是目前治疗RA的一线用药,其通过多种机制在RA治疗中发挥作用,如抑制TNF-α、IL-1、IL-12的分泌,降低MMPs活性等,因此本研究选用MTX作为阳性对照药物。CIA动物模型是一种由II型胶原诱发的免疫性炎症模型,主要表现为多发性末端关节炎,病理变化主要是增生性滑膜炎,继之关节软骨破坏直至骨的破坏,单核细胞浸入并持续存在于滑膜中,且动物体内存在针对自身Ⅱ型胶原的高滴度IgG抗体,说明其免疫功能变化兼有体液免疫及细胞免疫,这些变化均与人类RA相似,目前被公认为研究RA发病机制的经典动物模型,也是研究RA治疗药物的理想动物模型之一。研究小乌桂颗粒剂对CIA大鼠及其成纤维滑膜细胞(CIA-FLS)体外增殖的影响有助于进一步探讨小乌桂颗粒剂治疗RA的可能机制。目的1.评价小乌桂颗粒剂对CIA大鼠关节炎的治疗效果及相关细胞因子表达的影响。2.探讨小乌桂颗粒剂含药血清对CIA-FLS体外增殖及相关细胞因子分泌的影响。方法1.实验动物SPF级雌性SD大鼠82只(70只大鼠CIA造模后进行模型评价、小乌桂颗粒剂体内干预及CIA-FLS获取；12只大鼠小乌桂颗粒剂灌胃后用于含药血清获取),体重200g±20g,由南方医科大学实验动物研究中心提供(许可证号：NO.440210192)。2.实验药物小乌桂颗粒剂：小乌桂颗粒剂175g/剂(广东一方制药有限公司生产),主要组成：麻黄、桂枝、当归、党参、石膏、干姜、川芎、白芍、黄芪、川乌、知母、防风、附子、丹皮、黄芩、炙甘草。甲氨蝶呤片(上海信谊药厂),甲氨蝶呤粉剂(sigma公司)。3.研究方法3.1小乌桂颗粒剂对CIA大鼠关节炎的治疗效果及相关细胞因子表达的影响采用鸡Ⅱ型胶原建立CIA大鼠模型,运用关节炎指数(arthritis index, AI)评分法及病理切片炎症程度评分系统对其评价。将造模成功的CIA大鼠随机分为5组,每组8只,并于第22d开始,用蒸馏水配置的高中低剂量小乌桂颗粒剂(2ml/只/次/d)及MTX(0.9mg/kg/w)、蒸馏水空白(2ml/只/次/d)对各组CIA大鼠进行灌胃,连续21d。各组药物干预CIA大鼠后,每隔7d,用AI评分方法记录关节炎病变的发生及严重程度；干预21d(即造模42d)后,用病理切片的炎症程度的评分系统对各组大鼠膝关节进行病理评分。ELISA检测CIA大鼠干预前及干预的第21d外周血血清中TNF-α和IL-10的水平。3.2小乌桂颗粒剂含药血清对CIA-FLS体外增殖及相关细胞因子分泌的影响。组织块培养法体外分离培养CIA-FLS,光学显微镜下观察细胞形态,免疫组化法对细胞波形蛋白(vimentin)进行鉴定并进行细胞纯度计算。实验分为空白对照组、MTX组(0.3pmol/L)及高中低剂量小乌桂颗粒剂含药血清组5组,分别干预CIA-FLS24h、48h、72h,MTT法检测其增殖情况,ELISA检测培养上清中TNF-α和MMP-1的水平。4.统计学处理采用SPSS13.0统计软件,计量资料用均数±标准差(X±S)表示,正态分布计量资料多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用bonferroni检验；非正态分布计量资料采用多重非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.小乌桂颗粒剂对CIA大鼠关节炎的治疗效果及相关细胞因子表达的影响CIA造模后第21d,大鼠双侧足爪关节包括踝关节出现明显肿胀,76%(44/58)大鼠AI评分≥4,造模成功大鼠的整体AI评分X=6.68±0.77。高中低剂量的小乌桂颗粒剂组和MTX组干预CIA大鼠7d、14d、21d,其AI评分均明显下降,与模型组比较有统计学意义(p<0.05)；高中低剂量的小乌桂颗粒剂组和MTX组干预CIA大鼠21d,其病理评分下降,外周血血清TNF-α的水平降低,IL-10的水平升高,与模型组比较有统计学意义(p<0.05)。2小乌桂颗粒剂含药血清对CIA-FLS体外增殖及相关细胞因子分泌的影响。高中剂量小乌桂颗粒剂含药血清组和MTX组干预CIA-FLS24h、48h、72h均可明显抑制其增殖,培养上清中TNF-α、MMP-1的水平明显降低,与空白对照组差异具有统计学意义(p<0.05)；低剂量小乌桂颗粒剂含药血清组干预CIA-FLS48h、72h可明显抑制CIA-FLS增殖,培养上清中TNF-α的水平明显降低,其干预CIA-FLS24h、48h、72h培养上清中MMP-1的水平均明显降低,与空白对照组差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1小乌桂颗粒剂有效降低CIA大鼠的AI评分及病理学评分,其对CIA大鼠有治疗作用。2小乌桂颗粒剂有效降低CIA大鼠外周血血清中TNF-的水平、升高IL-10的水平,说明其可以纠正CIA大鼠相关炎症因子的失衡,这可能是其治疗RA机制之一。3.小乌桂颗粒含药血清可能通过抑制CIA-FLS增殖,并抑制CIA-FLS分泌TNF-α、MMP-1来减轻滑膜炎症反应,这也可能是其治疗RA的机制之一。