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体形是生物体最基本、最显著的特征之一。体形的大小会影响动物体的很多方面,从其外部形态和生理特征,到行为和生态特征。因此体形的决定机制是一个重要的生物学问题。尽管目前在果蝇、线虫等模式动物中,关于细胞、组织、器官和个体的形态大小的相关研究已有部分积累,但对于动物体形大小的调控也只是初步的认识。目前已知体形轮廓形成的基本过程,在于发育过程中形态因子和转录因子的表达调控及相互作用。很显然,体形形态上的差异远比体形轮廓上的多样性要多得多,而其分子调控机制是非常复杂的,至今存在大量的未解之谜。家蚕是鳞翅目的代表性昆虫,在其漫长的驯化选择和养殖过程中出现了诸多的体形突变体,也有为获得研究材料而人工诱导产生的体形突变体。樽蚕（tubby,tub）,为一种自然突变体,蚕体短粗肥胖,为隐性遗传。日本学者土井良宏等于上世纪80年代研究报道其遗传基因位于第23染色体上。本文作者的导师于1995年开始将其通过杂交导入常用实验品系大造（Dazao）,培育了樽蚕的近等基因系（Dazao-tub）,与受体亲本Dazao回交已超过30代,是一种研究体形（胖瘦）形成机制的珍贵模式材料。本研究利用分子标记定位方法确定樽蚕突变位点在基因组上的精确位置,结合基因功能注释、基因表达差异分析、克隆测序分析等方法筛选确定候选基因,利用RNAi等手段研究基因的功能,并结合转录组测序结果分析樽蚕突变产生的调控机制。获得的主要研究结果如下:1.樽蚕突变体的表型分析为了充分掌握樽蚕的表型特征,我们对其进行了连续的观察分析。发现在整个生命周期（胚胎、幼虫、蛹、成虫）,樽蚕都表现出短而胖的表型,且幼虫期表型最为明显,腹部膨胀呈纺锤形。对野生型大造与大造-tub突变体幼虫期的躯体长度,第2、第3、第4腹节体节宽度,躯体重量进行测量和比较。结果显示,樽蚕Dazao-tub的体长显著短于野生型Dazao（p=0.002）,第2、3、4腹节体节宽度要显著大于野生型Dazao（平均p=0.001）;5龄幼虫期的体重测量显示,樽蚕Dazao-tub的体重要显著大于野生型Dazao。同时我们观察并测量了胚胎转青期野生型大造和突变体大造-tub的体长与体宽,结果表明,转青期樽蚕突变体的体长显著短于野生型大造(（p<0.0001）,体宽要显著大于野生型大造（p<0.001）。而且,胚胎期的体长与体宽之比与幼虫期体长与体宽之比类似,说明胚胎期与幼虫期具有相似的体形模式,暗示了樽蚕突变体短胖的体形特征在胚胎期就已经被决定了。2.樽蚕位点的分子定位配制杂交分离群体,利用已有SSR标记及自行设计的多态性分子标记,对388个BC1M群体中的突变个体进行基因分型,初步将tub位点锁定在23号染色体nscaf3026上的分子标记P1和A1之间约2Mb的范围内。然后,在初定位区间内继续补充设计新的多态性分子标记,并扩大定位群体到1766个BC1M的突变个体,进行精细定位,将tub位点锁定在标记M1和M6之间约208kb的范围内。此区间内有4个标记（M2、M3、M4和M5）与tub位点均为紧密连锁（不交换）。在家蚕基因组数据库中该区域内存在9个预测基因。3.候选基因筛查分析我们通过生物信息分析并结合序列扩增测序,最终发现候选区域内实际上存在4个基因,分别是:BGIBMGA011360,Bmscarface,BGIBMGA011364和BmFGF。采用荧光定量PCR方法调查了这4个基因在幼虫期的表达,发现其中2个基因（Bmscarface和BGIBMGA011364）在tub突变体（Dazao-tub）中的表达量显著低于野生型Dazao。设计引物扩增这4个基因的cDNA序列,发现只有Bmscarface基因扩增产物在野生型Dazao和突变体Dazao-tub中存在多态性。我们对其进行基因分型分析,结果显示该基因与tub位点间没有发生重组。而其他3个基因的cDNA扩增产物大小一致,通过克隆测序后发现BGIBMGA011360和BmFGF基因在野生型Dazao和突变体Dazao-tub中氨基酸序列完全一致,而BGIBMGA011364基因在ORF框中仅存在一处单个氨基酸的替换。随机挑选没有突变表型的其他家蚕品系进行多品系验证,发现这一个氨基酸的替换并不是突变体本身特异的。所以我们将Bmscarface基因作为候选基因进行进一步研究。4.候选基因的克隆与序列分析我们在野生型Dazao和突变体Dazao-tub中克隆了Bmscarface基因的cDNA序列,发现在Dazao中Bmscarface基因的ORF框全长5451bp,包含13个外显子,编码1817个氨基酸,包含一个Tryp-SPc结构域。接着我们分析比较了突变体Dazao-tub中Bmscarface基因与野生型Dazao之间的差异。结果显示:突变体Dazao-tub中Bmscarface基因在第1外显子上缺失3bp和312bp,第6外显子上缺失48bp,虽然缺失并没有导致ORF框被破坏,但导致丢失121个氨基酸,通过信息分析发现序列的缺失导致了蛋白空间结构的改变。接下来我们通过家蚕多品系的验证,发现第1外显子上312bp的缺失为突变体本身所特有的。通过同源性分析及系统发生分析,发现Bmscarface基因只在鳞翅目昆虫中高度保守,且该基因在许多物种中只存在其旁系同源基因,其功能有待研究。5.Bmscarface基因的时空表达模式分析及受蜕皮激素的影响由于突变体短胖的表型在各阶段存在,因此我们调查了Bmscarface从胚胎期到成虫期的表达模式,结果显示:Bmscarface基因在胚胎早期不表达,直到气管形成期开始表达;在幼虫期,Bmscarface基因的表达模式呈脉冲型,即每个龄期刚眠时几乎不表达,而眠中期表现出很高的表达水平,随后降低;在幼虫食桑期仍有表达。此外,在上蔟42小时Bmscarface基因的表达又出现一个高峰,随后降低,在蛹中期出现一个小的波峰。组织表达模式显示:Bmscarface基因在幼虫的表皮、头和气管中高量表达,其他组织几乎不表达。利用20E处理家蚕5龄幼虫后发现,处理24小时后,Bmscarface基因表达量显著低于对照组;利用20E处理家蚕胚胎细胞发现,处理12小时后,Bmscarface基因的表达量同样显著低于对照组,这表明Bmscarface基因的表达与蜕皮激素滴度呈负相关。6.Bmscarface基因的功能验证为了验证Bmscarface基因的功能,我们设计并合成了双链RNA（dsRNA）,在胚胎期通过注射dsRNA下调Bmscarface在野生型中的表达量,结果显示干涉组刚孵化的蚁蚕中31%的个体表现出类似突变体的短胖表型,对这些个体的体长与体宽进行测量,发现其体长显著短于对照组,而体宽显著宽于对照组,且体长与体宽之比与突变体本身无显著性差异。这证明Bmscarface基因为导致tub突变的基因,并初步表明Bmscarface基因参与家蚕体形的调控。7.家蚕tub突变体的转录组测序及数据分析通过RNAi我们验证了Bmscarface基因的功能,为了研究其参与体形调控的机制,根据其体形在胚胎期就已经决定且Bmscarface基因在气管形成期高量表达的特点,我们采集了野生型Dazao和纯合突变体Dzao-tub在气管形成期的胚胎进行RNA测序。分析在该时期表达的基因,比较2个转录组数据,共得到差异表达基因696个,其中上调表达的基因有201个,下调表达的基因有495个,而在定位区间内的差异表达基因只有Bmscarface。我们重点关注了一些参与体形调控的信号通路上的基因,如胰岛素信号通路、mTOR信号通路、Hippo信号通路等,这些通路上的基因的变化可以影响体形大小的变化,这可能为研究樽蚕体形大小调控的分子机制提供了重要线索。8.樽蚕表型形成的分子机制初探据报道,在果蝇中scarface基因在胚胎闭合过程中作为JNK信号通路的一个新的基因,在表皮形态形成过程中对JNK信号通路的活动起到了负调节作用。而JNK路径的任何变化都可能影响到dpp的表达。因此,我们调查了胚胎气管形成阶段当Bmscarface开始高表达时,dpp的表达水平,结果:在突变体Dazao-tub中dpp的表达水平显著高于野生型Dazao。然后,我们调查了注射Bmscarface双链RNA后,Bmscarface基因的表达被显著下调时,dpp的表达水平,结果:在Bmscarface表达降低的个体中dpp的表达要显著高于对照组,即与在Dazao-tub个体中的表达相一致。我们初步推测,在突变体中高量表达的dpp可能引起外侧表皮的过度扩张,从而导致更宽的躯体异常的表型。