面对日益枯竭的自然资源，通过生物冶金对低品位矿藏和尾矿进行回收成为对现有资源的一种有效利用形式。喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus，简称A．c）是一种广泛分布于硫化矿床的专性自养极端嗜酸性硫杆菌（Acidithiobacillus），是一种重要的浸矿微生物。但这一类细菌生长缓慢，代时长，细菌得率低，对某些重金属离子缺乏抗性，因此生产效率较低，在大规模矿样处理中其实际作用效果受到了限制。为了提高硫细菌的浸矿能力，亟待对其进行遗传改造。目前，将外源基因导入嗜酸性硫杆菌最为成功的方法是接合转移，但是现在用于接合转移的IncQ族质粒载体分子量较大，多克隆位点少，遗传操作难度大，限制了进一步的研究工作。这就要求我们构建新的质粒载体以满足研究和应用需要。 本文以具有广泛宿主范围IncR族质粒载体pBBRIMCS-2为出发质粒，以链霉素抗性基因置换了质粒上的卡那霉素抗性基因作为选择标记，构建了新的具有链霉素抗性的低分子量质粒载体pMSD1（5，602bp）和pMSD2（5，833bp），其中质粒载体pMSD1没有启动子，而质粒pMSD2含有强启动子tac。为了验证构建的质粒载体的性质，以卡那霉素抗性基因为报告基因，构建了重组质粒pMSD1-Km，pMSD2-Km，以携带卡那霉素抗性基因的实验室原有IncQ族质粒pJRD215为对照，分别在大肠杆菌和喜温硫杆菌中比较检测了卡那霉素抗性基因的表达情况。实验表明，含有强启动子tac的质粒载体pMSD2具有最高的表达卡那霉素抗性基因的能力，而卡那霉素抗性基因依靠基因自身启动子时，质粒载体pMSD1上的表达能力比质粒载体pJRD215弱一点。同时也对不同质粒载体从大肠杆菌向嗜酸性喜温硫杆菌接合转移的频率和在嗜酸性喜温硫杆菌中的稳定性进行了比较检测，通过平皿菌落计数法计算接合转移频率。质粒pMSD2-Km的接合转移频率约为1．38±0．64×10-5。在无选择压力的条件下，A．caldus（pMSD2-Km）连续传代50次，质粒载体的保留率约为75±2．7％，而实验室原有的质粒载体pJRD215的接合转移频率约为3．33±0．72×10-5，在无选择压力下连续传代50次之后质粒保留率约为79±3．2％。表明基于IncR族质粒构建的质粒载体pMSD2和pMSD1是一种能够向嗜酸性喜温硫杆菌接合转移并能在嗜酸性喜温硫杆菌中稳定存在的表达载体。 运用实时定量PCR的方法，初步测定了质粒pMSD2-Km和pJRD215在大肠杆菌和喜温硫杆菌中的拷贝数。在大肠杆菌JM109中，以大肠杆菌染色体组单拷贝基因D-1-脱氧木酮糖磷酸合成酶基因（D-1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase，简称dxs）为内标基因，以质粒卡那霉素抗性基因为参比基因；在喜温硫杆菌MTH-04中，以喜温硫杆菌染色体组基因核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase，简称Rubisco）大亚基基因序列为内标基因，以质粒的链霉素抗性基因为参比基因。分别提取含有质粒的菌株E．coli（pMSD2-Km），E．coli（pJRD215），A．caldus（pMSD2-Km）和A．caldus（pJRD215）的总DNA进行适时定量PCR实验。试验结果表明：质粒pMSD2-Km和pJRD215在大肠杆菌的拷贝数分别约为5～6拷贝（4．2％～6．3％）和15～17拷贝（4．7％～6．9％），而在喜温硫杆菌MTH-04中的拷贝数分别约为5～6拷贝（3．0％～5．2％）和14～15拷贝（2．3％～4．5％）。 在此基础上以来自于大肠杆菌质粒pUM3的抗砷基因为目的基因，构建重组质粒pMSD1-As，pMSD2-As。以实验室原有基于质粒pJRD215构建的抗砷质粒pSDRA1为对照，通过接合转移的方法，分别转入喜温硫杆菌MTH-04，获得抗砷基因工程菌株A．caldus（pMSD2-As），A．caldus（pMSD1-As）和A．caldus（pSDRA1），进一步检测了各菌株在含有不同浓度亚砷酸钠的培养基中的生长情况。结果表明：对照工程菌A．caldus（pSDRA1）的最大耐受浓度为40mmol/L，新构建工程菌A．caldus（pMSD1-As）的最大耐受浓度也为40mmol/L，但是菌体量低于工程菌A．caldus（pSDRA1）。而新构建工程菌A．caldus（pMSD2-As）具有最强的抗砷能力，最大耐受浓度为45mmol/L。 本实验成功构建了具有广泛宿主范围IncR族质粒载体pMSD1和pMSD2，该系列质粒具有接合转移频率高，分子量小，表达效率高及稳定性高等特点，为进一步对硫细菌的遗传改造奠定了基础；运用实时定量PCR的方法，初步测定了质粒pMSD2-Km和质粒pJRD215在大肠杆菌和喜温硫杆菌的质粒拷贝数；在此基础上，以质粒载体pMSD1和pMSD2为基础，构建了具有高抗砷能力的工程菌株。