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碳青霉烯类抗生素是人医临床治疗革兰氏阴性菌多重耐药感染最重要的抗菌药物之一,鉴于碳青霉烯类抗生素在感染性疾病防治过程中的重要地位,国内外均未批准动物使用该类药物,但随着碳青霉烯类药物在人医临床中的广泛使用,碳青霉烯类耐药革兰氏阴性菌已在国内外大量出现并广泛传播。多黏菌素作为动物促生长剂在我国养殖业上的应用可以追溯至上世纪80年代,并且被认为是治疗碳青霉烯耐药菌感染的"最后一道防线",自2016年我国首次报道了畜禽源质粒介导可转移黏菌素耐药基因mcr·-1后,多黏菌素耐药性已引起世界关注。目前我国鸡源大肠杆菌已产生碳青霉烯和多黏菌素耐药株,但还未系统地对整个肉鸡产业链中耐药基因的传播情况进行跟踪研究,因此本论文重点调查分析了肉鸡产业链中大肠杆菌对碳青霉烯和多黏菌素的耐药情况,并在此基础上揭示了碳青霉烯和多黏菌素耐药基因在我国动物性食品及人群中的流行特征和传播方式。本研究自2014年11月至2015年8月从某地肉鸡产业链条(种鸡场—商品鸡场—肉鸡屠宰场—超市)上分别收集了鸡、狗、家燕、和养殖人员的粪便以及污水和苍蝇样本共计739份,其中种鸡场和商品鸡场经常使用阿莫西林、氨苄西林、环丙沙星、庆大霉素以及多黏菌素E等抗菌药物作为预防和治疗疾病用药。经肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药株的分离鉴定和耐药基因的筛查,获得161株大肠杆菌、55株肺炎克雷伯菌和29株阴沟肠杆菌。245(33.2%)株碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌呈NDM阳性,其中37株大肠杆菌同时携带mcr-1。此外,样本中耐药基因blaNDM和mcr-1的检出率明显高于耐药菌株的分离率,推测耐药基因blaNDM和mcr-1可能存在于其它不可常规培养的细菌中。虽然种鸡场未分离出耐碳青霉烯大肠杆菌,且样品中也未检测出laNDM基因,而在后三个环节的样本中可以分离出碳青霉烯耐药大肠杆菌(CREC)并且检测出NDM阳性样品,其分离率和检出率范围分别为10%-29.2%和33.3%-62%;而在肉鸡生产链条的四个环节都能分离和检测出mcr-1阳性菌株和样品,其菌株分离率和样品检出率范围分别为25%-49.7%和85.8%-97.0%。对161株碳青霉烯耐药大肠杆菌(CREC)和55株碳青霉烯敏感大肠杆菌(CSEC)进行多位点序列分型(MLST),结果发现除获得41个已知ST型外,另有23株菌获得了 11个ST新型。其中,ST156(31株)、ST101(19株)和ST746(13株)是NDM阳性大肠杆菌中较普遍的ST型,ST746型大肠杆菌仅携带NDM-5,不携带其他NDM变体;ST156和ST10大肠杆菌的宿主来源最丰富,不仅来源于肉鸡生产链的4个环节,还来源于商品鸡场的所有环境因素;在37株同时携带blaNDM和mcr-1的大肠杆菌中,ST156(18株)是最普遍的一种分型。对174株大肠杆菌(161株CREC和13株随机挑选的CSEC)和6个国家12株NDM阳性大肠杆菌(GenBank下载)进行亲缘关系分析,发现种鸡场-商品鸡场-屠宰场-超市来源的部分大肠杆菌亲缘关系相近,商品鸡场的鸡群、家燕、饲养员、狗、苍蝇和污水来源的部分大肠杆菌亲缘关系也相近,并且本研究的部分菌株和来自6个国家12株NDM阳性大肠杆菌的亲缘关系也相近,表明CREC可能在整个肉鸡产业链条、商品鸡场的不同环境因素甚至不同国家和地区之间互相传播。对161株CREC(其中37株携带mcr-1基因)进行blaNDM和mcr-1基因的定位,结果显示blaNDM基因定位在112(69.6%)株大肠杆菌的质粒上,mcr-1基因定位在31(83.8%)株大肠杆菌的质粒上,这些质粒大小在30 kb至280 kb之间,未发现两种耐药基因定位于同一质粒。对37株同时携带blaNDM和mcr-1因的大肠杆菌进行接合转移实验,结果显示20株菌的blaNDM基因和24株菌的mcr-1基因能单独发生接合转移,接合转移频率范围分别是9.0 × 10-10-5.0 × 10-3和3.7× 10-5-3.2 × 10-1另外,5株大肠杆菌携带的两种耐药基因可以共转移。通过对上述174株大肠杆菌(161株CREC和13株随机挑选的CSEC)进行全基因组测序,结果显示共有4种NDM变体,定位于三种基因环境中,其中NDM-5(84株)、NDM-9(55株)、NDM-1(21株)和NDM-7(l株),每种NDM变体主要对应一种基因环境,其中85.7%(18/22)的blaNDM-1主要定位于Ⅲ型基因环境;98.8%(83/84)的blaNDM-5主要定位于Ⅱ型基因环境;92.7%(51/55)的blaNDM-9主要定位于Ⅰ型基因结构中。174株菌中有44株MCR-1阳性大肠杆菌,并且mcr-1基因定位于4种基因环境中。通过菌株全基因组和其携带的blaNDM基因片段分别构建的进化树进行关联性分析,发现blaNDM大肠杆菌中主要以水平转移的方式进行传播。综上所述,大肠杆菌能携带黏菌素耐药基因mcr-1从种鸡场沿着肉鸡产业链传播到超市,提示mcr-1基因的产生是由于养鸡业中大量使用多黏菌素引起的;而blaNDM基因虽然在商品鸡场的鸡、家燕、狗、苍蝇,甚至饲养员携带的大肠杆菌中阳性率极高,并且能传播至下游链条,但是从种鸡场来源的样本中未检出碳青霉烯耐药基因,加上分离的碳青霉烯耐药大肠杆菌和澳大利亚、新加坡、挪威、美国、哥伦比亚以及中国人医临床分离的碳青霉烯耐药大肠杆菌有密切的亲缘关系。因而推测家禽生产链中流行的blaNDM基因来源于商品鸡场的环境因素,并可通过候鸟迁徙、苍蝇或者人员接触进行扩散。阐明了其耐药基因在我国肉鸡产业链上的产生源头与传播规律,为动物源碳青霉烯和多黏菌素耐药菌的产生、传播扩散与控制以及风险评估提供了充实的科学依据。