粪菌移植(Fecal Microbiota Transplantation,FMT)技术近年来被引入艰难梭菌感染、炎性肠病、糖尿病、自闭症等多种疾病的治疗,它是将健康人的粪便菌群转移到患者的肠道中,通过改变患者的肠道菌群、改善肠道稳态来治疗疾病的一种技术。粪菌移植的历史可追溯至中国古代医学中的粪便类药物,这其中,“金汁”作为粪便类药物的代表,在我国有着悠久的历史,治疗温病和急性中毒疗效确切。然而,令人遗憾的是,金汁的有效成分以及药理机制在中国古代医著以及现代中医药文献中却鲜有论及。金汁制作方法在医著中虽不完全一致,但其核心为将健康男童的粪便稀释、过滤后密封在坛子中,埋于土中一年甚至以上。从现代微生物学的角度来看,这个炮制过程就是低温、厌氧发酵的过程,金汁其实就是粪便菌群低温厌氧发酵后形成的由多种细菌组成的菌群及其代谢产物。本研究的目标是在实验室中建立金汁制备的模拟体系,动态监测发酵过程中菌群组成的变化和代谢物的特性,解释金汁可能的药理学机制,尝试用现代生物学语言来阐释金汁的科学内涵。本研究选择3名12-14岁男孩作为供体,采集新鲜粪便样本,等量混合,稀释过滤后制成粪悬液。根据有关研究,地下3米的温度一般为10~20℃。因此,我们设置了2个金汁制备模拟组—10℃厌氧发酵组(L组)和20℃厌氧发酵组(M组),另设常规细菌发酵温度37℃厌氧发酵组(C组)作为对照。将粪悬液在上述3个温度中进行厌氧发酵,期间连续采集样品,进行pH、菌群组成以及代谢物抗炎活性等检测。pH的分析显示,3个发酵体系在发酵2天时pH均显著下降。之后M组和C组趋于稳定,但L组仍缓慢下降。整个发酵过程中,L组pH最低,M组次之,C组最高。测序分析发酵过程中肠道菌群组成的变化规律。我们发现,依照医著中金汁制备的原则选择12-14岁男童作为供体,其肠道菌群中属于Faecalibacterium、Bifidobacterium和Roseburia等属的潜在益生菌含量高,而常见的机会病原菌含量极低,提示该年龄段人群肠道菌群在粪菌移植应用中具有优势。3个发酵体系菌群组成的动态监测显示,在发酵150天的过程中,L组中厌氧菌的活性显著高于其它两组,菌群组成的物种多样性也高于其它两组,菌群组成与初始粪悬液相比整体变化幅度较小;相反,作为对照的C组厌氧菌活性在发酵过程中大幅下降,菌群的物种多样性在3组中最低,其组成与初始粪悬液相比变化最大。进一步分析发现,L组在发酵过程中属于Blautia、Roseburia、Clostridium IV、Lactobacillus等属的OTU(Operational taxonomic units,操作分类单元)含量不断增加,从而使主要以这些属细菌为主的潜在益生菌含量也持续增加,至发酵150天时达到整个菌群的54.77%;M组中潜在益生菌的含量基本与初始粪悬液中的含量持平;而C组的潜在益生菌含量在发酵中显著下降。为进一步验证上述结果,我们提取各发酵体系中的菌群进行了体外产短链脂肪酸能力的检测,结果显示,L组发酵后的菌群产生丁酸的能力增加,显著高于其它两组。我们还利用TNF-α诱导的HT-29细胞炎症模型,检测了3组发酵体系中的代谢物对促炎细胞因子IL-8分泌的影响。结果显示,L组的代谢物使HT-29细胞产生IL-8的水平显著低于M组和C组,且远低于TNF-α诱导产生的IL-8水平,提示L组的发酵产物具有一定的抗炎活性。由上述分析可知,我们模拟的金汁制备的“低温、厌氧发酵”体系,尤其是10℃的发酵体系可以富集肠道菌群中的多种潜在益生菌,代表了一种更优化的肠道菌群结构,有可能与金汁发挥功效有关。为了进一步验证该结果,我们利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠肠炎模型,对L组发酵10天的样品对宿主的影响进行了研究。结果显示,发酵后的菌液有助于肠炎小鼠体重的恢复、疾病活动指数的改善以及结肠炎症的降低和肝、脾肿大的消减,提示发酵后的菌液对宿主具有益生效果。除上述研究外,本论文还分析了在粪菌移植中冻存粪悬液过程中冷冻保护剂(10%甘油)对细菌活性的影响。采集健康志愿者粪便样品,制作粪悬液后,将其分为三组:冻存前、冻存/无保护剂、冻存/甘油(10%)。采用细菌培养与菌群16S rRNA基因测序相结合的方法,比较了新鲜粪悬液与-80℃冻存1个月的粪悬液中活细菌的数量和组成。结果表明,不加保护剂直接冻存会显著降低粪悬液中活细菌的数量,新鲜粪悬液中仅7.1%的细菌能保持活性,其菌群多样性也显著下降;而10%的甘油具有保护肠道菌群活性的作用,新鲜粪悬液中41.5%的细菌在冻存后仍有活性,其菌群的组成结构也与新鲜粪悬液相似。研究结果表明,用10%甘油做保护剂冻存粪悬液是一种可行的粪悬液保存方法,但也提示了发展更有效的保存方法的必要性。综上所述,本研究借鉴中国古代中医药“金汁”的制备原理,在实验室建立了一种简单、稳定的肠道菌群模拟发酵体系,能够得到pH酸性且潜在益生菌含量高的结构优化的肠道菌群。这样一套方法体系可用于粪菌移植技术中粪悬液的制备以及以肠道菌群为靶点的益生菌药物、保健品等的开发。本研究对金汁模拟制备过程中的菌群变化规律的分析,为深入解析金汁的药效机制奠定了基础,也将为现代粪菌移植技术中供体菌群的制备提供新思路、新方法。