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组织工程化牙齿是利用干细胞培养和组织工程技术构建出具有生物学活性和生理功能的牙齿。用于牙齿再生的干细胞主要包括牙源性干细胞和非牙源性干细胞。牙髓干细胞、牙囊干细胞和牙周膜干细胞属于牙源性干细胞；而非牙源性干细胞主要包括骨髓基质干细胞和胚胎干细胞以及本实验所研究的诱导式多能干细胞等。由于牙源性干细胞来源有限，例如牙周膜干细胞只能从脱落的乳牙、拔除的第三磨牙以及正畸牙取得，限制了牙源性干细胞在临床治疗上的广泛应用。胚胎干细胞是一类具有无限增殖和高度自我更新能力的多潜能细胞，但是胚胎干细胞长期受着伦理上的争议以及免疫排斥的缺陷，也不适合应用于临床治疗。而患者体细胞来源的诱导式多能干细胞克服了伦理和免疫排斥上的障碍。有研究证实，诱导式多能干细胞可以向神经细胞、胰岛素分泌细胞、心血管和造血细胞、肝、肾等细胞分化，但是诱导式多能干细胞是否可以向牙源性细胞分化还未见报道。因此本研究探讨了诱导式多能干细胞作为组织工程牙齿再生的种子细胞的可能性，并分析了促进牙齿发育的适宜微环境。本课题研究内容如下：第一部分诱导式多能干细胞(iPS)的培养、鉴定目的：诱导式多能干细胞C5系(iPS)培养传代后进行体内外鉴定。方法：购买诱导式多能干细胞株，进行培养传代，体外鉴定实验，包括倒置显微镜细胞形态学观察，拟胚体制备，碱性磷酸酶染色，细胞免疫荧光染色；免疫缺陷鼠皮下移植进行体内鉴定。结果：诱导式多能干细胞的形态学观察：细胞呈集落状克隆团生长，克隆团多呈岛状或鸟巢状，边界清晰，表面光滑，细胞之间界限不明显；悬滴法培养iPS细胞可以形成拟胚体，呈圆球状；碱性磷酸酶染色呈阳性；0CT4和SSEA4表达阳性；体内可形成畸胎瘤。结论：诱导式多能干细胞是一类具有自我复制、自我更新和多向分化能力的全能干细胞。第二部分成釉细胞无血清条件培养液诱导小鼠iPS细胞分化的研究目的：探讨成釉细胞无血清条件培养液（ASF-CM）对小鼠iPS细胞的诱导能力。方法：构建iPS细胞与成釉细胞无血清条件培养液非接触式共培养体系，倒置显微镜观察分化后细胞的形态学变化，细胞免疫荧光染色检测诱导后细胞的表型变化。结果：iPS细胞与成釉细胞无血清条件共培养后，细胞增殖良好镜下观察有成釉细胞样细胞形成。细胞免疫荧光检测显示经诱导的iPS细胞阳性表达成釉细胞标记物AMBN、AMGN和CK14。未诱导的iPS细胞这些基因表达呈阴性。结论：成釉细胞无血清条件培养液可以促进iPS细胞向成釉细胞谱系分化。第三部分BMP4诱导小鼠iPS细胞牙向分化的研究目的：探讨加入了外源性BMP4的成釉细胞无血清条件培养液(ASF+BMP4)对小鼠iPS细胞的诱导能力。方法：分别构建iPS细胞与ASF-CM或ASF+BMP4非接触式共培养体系，体外实验：倒置显微镜观察两种不同条件液诱导后细胞的形态学变化，细胞免疫荧光染色检测诱导后细胞的表型变化；体内实验：制备两种不同条件液诱导后的iPS细胞聚合体，复合CBB支架材料，小鼠肾被膜下移植。结果：体外实验：iPS细胞与ASF-CM共培养后，镜下观察有鹅卵石状成釉细胞样细胞形成。细胞免疫荧光检测显示经诱导的iPS细胞阳性表达AMBN、AMGN和CK14，不表达成牙本质细胞特异性标记物DMP-1和DSP；iPS细胞与ASF-BMP4共培养后，镜下观察不仅有成釉细胞样细胞形成，还可以见到成牙本质样细胞生成。细胞免疫荧光检测显示经诱导的iPS细胞AMBN、AMGN、CK14， DMP-1和DSP表达均呈阳性。体内实验：iPS细胞与ASF-CM共培养后，制备iPS细胞聚合体/CBB复合体，小鼠肾被膜下移植，6周后取材，HE染色：可见形成大量的角化上皮样结构；iPS细胞与ASF-BMP4共培养后，制备iPS细胞聚合体/CBB复合体，小鼠肾被膜下移植，6周后取材，HE染色：不仅能见到形成典型的牙上皮样结构，还可以见到，外形规则的排列整齐、结构清晰的牙本质样结构；未诱导的iPS细胞未见到牙齿样结构，均形成外、中、内三个胚层的畸胎瘤。结论：加入了BMP4的成釉细胞无血清条件培养液提供了更有利于牙齿发育的生长因子微环境，可以促进iPS细胞向成釉细胞谱系和成牙本质细胞谱系分化。第四部分iPS牙向分化中Noggin对BMP4的拮抗作用目的：分析成釉细胞无血清条件培养液中对小鼠iPS细胞起着牙向诱导能力的生长因子。方法：构建iPS细胞与三种不同条件培养液（ASF-CM，ASF+BMP4，ASF+Noggin）非接触式共培养体系，倒置显微镜观察分化后细胞的形态学变化，在诱导7天和14天，利用RT-PCR和Western Blot检测诱导后细胞的表型变化。结果：iPS细胞与成釉细胞无血清条件共培养后，镜下观察有成釉细胞样细胞形成。iPS细胞与ASF+BMP4共培养后，镜下观察有成釉细胞样细胞和成牙本质细胞样细胞形成。ASF+Noggin共培养后，镜下观察细胞呈不规则的长梭形，未见有牙源性细胞形成；RT-PCR检测显示在培养7天时，ASF-CM组和ASF+BMP4组主要表达牙胚发育早期基因Pax9、Msx2。ASF+Noggin组Pax9和Msx2表达不明显；在培养14天，ASF-CM组和ASF+BMP4组主要表达牙胚终末分化的基因AMBN、DMP-1、DSPP。ASF+Noggin组AMBN、DMP-1、DSPP表达均不明显；在相应的时间点，这些基因的表达ASF+BMP4组显著高于ASF-CM组，而ASF+Noggin组与ASF-CM组相比，这些基因的表达明显降低。Western Blot结果与RT-PCR结果相一致。结论：成釉细胞条件培养液中的内源性BMP4发挥着传递成牙信息的重要作用，促使iPS细胞向牙源性方向分化。加入的外源性BMP4放大了内源性BMP4的信号调控作用；外源性Noggin阻断了ASF-CM中内源性BMP4的信号传导。