研究背景： 大肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一，转移是大肠癌患者死亡的主要原因。确定有无转移及其影响因素是判断患者预后、指导治疗的重要指标。因此，探讨与大肠癌转移相关的因素，寻找预防和治疗的有效途径，是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。 肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程。研究表明其每一阶段都受着许多特殊基因的调控，主要分为促进转移发生的转移基因和抑制转移发生的转移抑制基因两大类，它们相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性。 目前报道的参与大肠癌转移调控的基因已达百种，这些基因已为阐述大肠癌转移的分子机制提供了重要的线索，但仍远远不能解释转移过程的复杂性和多样性；再加上这些基因研究的检测手段多限于一种或几种基因的表达，不能全面反映各基因间的关系及发现未知基因，因此寻找一种全面、高效、便捷的分析方法就成为解决这一问题的关键。 对差异基因进行克隆与功能研究是了解肿瘤发生发展过程的重要策略，新近发展的几种差异表达分析技术如抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)、双向电泳(Two Dimensional Gel Electrophoresis，2-DE)、质谱(Mass Spectrometry，MS)等技术为阐述肿瘤发生发展的分子机制、克隆目的基因及发现新基因提供了重要手段。复杂生物体的差异基因表达分析涉及转录组和蛋白质组方法，它们在方法学上各有优势和不足。两者的结合应用，是全面、系统阐述肿瘤转移机制的有效途径。 目的与方法： 本研究采用一对国内外通用、遗传背景一致、人大肠癌高转移能力细胞株SW620和低转移能力细胞株SW480为实验对象，首先通过绘制生长曲线、体内转移及体外侵袭实验，观察长期传代对其转移表型的保持有无影响;其次，在RNA水平上，利用SSH和蓝白斑筛选技术构建大肠癌转移相关基因消减cDNA文库，再通过Difl七rentiai screening(Ds)和Nodhem Bfot对部分阳性克隆进行筛选验证，并对获得的差异片段的性质或功能进行初步分析;最后，在蛋白质水平上，利用2一DE技术获得两种细胞株的蛋白表达谱，通过软件分析选取一些蛋白差异点，酶解后利用MS初步确定其性质。本研究不仅有利于阐述大肠癌转移的分子机理，还能提供新的网上信息资源，并有望为临床上早期诊断、药物筛选和预后判断寻找新的靶点。结果:1.大肠癌转移性细胞株相关生物学特性的研究 人大肠癌高转移细胞株SW620的体外增殖能力高于低转移细胞株SW480;体内成瘤及自发转移实验验证了SW620细胞株的转移能力高于SW480;体外侵袭实验提示S丫V48O细胞株的侵袭能力高于SW620，与国外学者的报道相符，但与体内研究结果不一致。 经过体外长期传代，本研究所用的一对转移性人大肠癌细胞株仍具有转移表型的差异，它们是进行晚期结肠癌遗传学改变研究的一种重要实验模型;细胞体内外实验结果的不一致提示粘附、运动机制及宿主内环境影响等可能是造成这种差异的原因之一。2.利用SSH和DS技术筛选大肠癌转移相关基因 首次构建了人大肠癌转移促进基因或抑制基因的两个消减cDNA‘文库，分别含有235个和232个白色克隆。两个文库中，90%以上的白色克隆均含有插入片段。 部分阳性克隆经过筛选验证后，共获得了25个差异表达基因，10个为已知基因，其中5个基因在高转移细胞株SW620中差异表达，可能有促进转移的作用，包括热休克蛋白10(Heat shock Proteinlo，HsP10)、细胞色素氧化酶现仁ytochrome C Oxidasen，。。xll)、有丝分裂调控蛋白dis3人同源物(M itotic control阮tein由53 homolog，Dls3)、x连锁的人核糖体蛋白54(几bosomal Protein S4X一linked，RPS4X)及血浆淀粉样蛋白A(S erum amylofdA，SAA);另外5个基因在低转移细胞株SW480中差异表达，具有潜在的转移抑制作用，包括Tomoregulln、真核翻译起始因子4A(Euk川了otic Translation Initiation Factor 4A，EIF4A)、人细胞色素氧化酶m的类似物(51而lar to eytoe腼me e oxidasem，CoXm)、谷肤甘肤S转移酶3( GhitathioneS一transferase mu3，GSTM3)及线粒体nNA (Mitoehondrion DNA，mtDNA)。以上10个已知基因，基本上是一些与细胞生长分化、代谢合成、转录、凋亡及信号转导等相关的基因，其功能的多样性也证实了肿瘤转移机制的复杂性;除DIS3与SAA外，其余基因与大肠癌转移的关系在本研究中首次被报道，它们大多不同程度地参与了多种肿瘤的癌变过程，说明肿瘤的发生发展是个持续的、逐步累积的过程;其功能还需结合其它方法进一步验证。 本研究筛选出的巧个未知基因，已被GeneBank dbEST库收录，登录号为CD485499一CD485513，其中有6个基因定位于5号染色体上。以上基因的性质和功能还有待进一步研究。3.利用2-DE和MS技术筛选大肠癌转移相关蛋白 首次获得两种转移性大肠癌细胞株的2一DE蛋白表达谱，具有良好的重复性和可比性;采用非线性PH3一10及重叠窄范围的固相PH梯度 (Lnmobilized PH Gradients，IPG)胶条，提高了2一DE的分