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杀稻瘟菌素（Blasticidin S,BS）是由灰色产色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）产生的肽核苷类抗生素,由于良好的生物活性并且对鱼类无毒害,使它取代有机汞成为第一例大规模用于防治水稻稻瘟病的生物制剂。BS生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素（LBS）被水解成为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2（Streptomyces lividans WJ2）清洗过的细胞均能催化这一步反应。实验室前期确定这两株菌均有3个氨肽酶PepN的同源蛋白,其中PepN1主要负责水解LBS和亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素（LDBS）,且两菌株的PepN1催化效率相当。但是,相比于灰色产色链霉菌只积累BS这一种组分,变铅青链霉菌WJ2还积累了LBS和LDBS,暗示PepN1在两菌株中的表达调控存在差异。本研究利用PepN1的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹法（Western blot）比较了培养2-6天的灰色产色链霉菌和变铅青链霉菌WJ2在细胞内PepN1的表达水平。结果显示:灰色产色链霉菌第2-6天细胞内PepN1水平基本没有变化,而WJ2自第4天起细胞内PepN1开始减少,到第6天完全消失。WJ2中PepN1在培养后期消失原因可能是由于:1)被分泌到细胞外;2)体内被蛋白酶降解;或/和3)细胞死亡等原因造成。硫酸铵沉淀收集两种菌株培养液中的蛋白,重悬后使用Western blot检测PepN1的水平变化及其体外水解LDBS的活性。结果显示:灰色产色链霉菌培养液中含有PepN1,而WJ2培养液中未检测到PepN1。说明灰色产色链霉菌能够将PepN1分泌至细胞外,而变铅青链霉菌WJ2却不能。对灰色产色链霉菌和变铅青链霉菌基因组中所有分泌系统蛋白进行生物信息学分析,发现两菌株中共有5个分泌系统蛋白相似性低,还有1个分泌系统只存在于灰色产色链霉菌中。将灰色产色链霉菌中编码的这6个分泌系统蛋白的基因分别导入变铅青链霉菌WJ2后,检测到其中5个突变株培养液中含有PepN1,说明这些分泌系统蛋白参与PepN1的分泌。对这些突变株的发酵产物分析发现:PepN1分泌到培养液中有利于LBS向BS的转化,但产物中仍有LBS存在。在研究氨肽酶PepN1是否会发生自剪切时,结果发现PepN1会有小量的自发降解,同时Mg2+对PepN1有稳定作用。在分析PepN1能否被无细胞裂解液（CFE）中某些蛋白酶降解时,利用Western blot检测PepN1的变化,结果发现PepN1会被CFE降解,但降解作用非常弱。同时,未发现PepN1的特异性降解条带,PepN1有可能被CFE中的蛋白酶非特异性降解。总体来说,灰色产色链霉菌中的PepN1sgr比变铅青链霉菌中的PepN1sli更加稳定。但是PepN1sli的自剪切和CFE中蛋白酶对PepN1sli的降解都比较弱,不会导致细胞内PepN1sli的完全消失。对两菌株在培养至6天的生长状态进行分析,发现细胞培养至第3天已进入衰亡期,但在变铅青链霉菌WJ2培养液中并没有检测到PepN1。说明细胞衰亡这一点可能不是导致PepN1在培养后期消失的原因。使用荧光蛋白标记的方法研究PepN1在细胞内的定位。本研究将编码红色荧光蛋白mRuby3和PepN1的基因融合,并加上KasOp强启动子以增强表达。将融合基因导入灰色产色链霉菌和变铅青链霉菌WJ2中,通过荧光观察研究两菌株细胞内PepN1的分布。结果显示,荧光主要位于细胞内,表明PepN1位于细胞内,两菌株细胞内PepN1分布相同。与灰色产色链霉菌相比,变铅青链霉菌WJ2的分泌系统不能将PepN1分泌到细胞外。出于自我保护的目的,BS异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2在细胞内水解LBS生成BS的效率降低,因此其发酵产物中BS产量低且含有LBS等中间产物。