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目的:观察针刺对缺血缺氧脑损伤(Neonatal hypoxic-ischemic brain disorders,HIBD)对新生大鼠的学习记忆能力和神经行为的影响,评价不同时长(5min,10min,15min)的宫内窘迫对HIBD新生大鼠脑组织形态和神经功能缺损程度的影响,探讨更贴合临床实际的宫内窘迫HIBD新生大鼠模型;观察不同时长缺血缺氧脑损伤与神经元自噬的联系,探讨神经元自噬在新生儿缺血缺氧脑损伤中的角色和作用;观察针刺对宫内窘迫HIBD新生大鼠神经元自噬蛋白表达和神经元超微结构的影响,初步揭示针刺调控神经元自噬水平,改善宫内窘迫HIBD新生大鼠缺血缺氧脑损伤和神经功能缺损的作用机制。方法:应用不同时长(5min,10min,15min)的宫内窘迫剖宫产术建立新生儿缺血缺氧脑损伤(Neonatal hypoxic-ischemic brain disorders,HIBD)模型。本实验分为三个部分:(1)评价不同时长缺血缺氧对HIBD新生大鼠学习记忆能力(旷场实验、水迷宫实验)的影响;(2)应用透射电镜、HE染色技术观察不同时长的缺血缺氧对HIBD新生大鼠脑组织形态和超微结构的影响;(3)应用WestemBlot技术观察不同时长的缺血缺氧对HIBD新生大鼠海马神经元自噬蛋白表达(Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62)的影响,探讨神经元自噬在新生儿缺血缺氧脑损伤中的角色和作用。最终,探讨出更贴合临床实际的宫内窘迫HIBD新生大鼠模型。应用宫内窘迫剖宫产术建立新生儿缺血缺氧脑损伤(Neonatal hypoxic-ischemic brain disorders,HIBD)模型。出生后第 14 天(Postnatal day 14,PND14),给予 HIBD新生大鼠针刺(神庭穴、双侧本神穴、脑户穴、双侧脑空穴、双侧颞三穴)干预,每天干预一次,连续干预14天,每穴进针后,均匀、快速地捻转针柄10次,捻转完成后即刻出针,不留针。本部分(第四部分)实验旨在观察针刺对宫内窘迫HIBD新生大鼠海马神经元自噬蛋白表达(Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62)和海马神经元超微结构的影响,初步揭示针刺调控神经元自噬水平,改善宫内窘迫HIBD新生大鼠缺血缺氧脑损伤和神经功能缺损的作用机制。结果:(1)第一部分实验研究发现,与正常组比较,假手术组新生大鼠平均水平活动次数无明显变化(P＞0.05),5min组、10min组和15min组大鼠平均水平活动次数均减少(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。与正常组比较,假手术组新生大鼠平均水平活动次数无明显变化(P>0.05),5min组、10min组和15min组大鼠平均水平活动次数均减少(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。与正常组相比,假手术组、5min组大鼠定位航行实验各天的逃避潜伏期以及空间搜索实验的穿台次数与游泳总路程无明显变化(P＞0.05),说明手术不是模型的干扰因素;与正常组相比,10min组和15min组大鼠各天潜伏时间明显延长(P<0.01,P<0.001),穿台次数与游泳总路程减少(P<0.01,P＜0.001),说明模型组出现了空间学习记忆障碍,造模成功。(2)第二部分实验研究发现,200倍显微镜下观察海马CA1区可见正常组及假手术组锥体细胞排列致密、有序、层次分明,细胞形状规则,核仁清晰;15min组锥体细胞减少甚至消失,排列无序结构疏松,细胞间隙增大,细胞形状不规则,多数细胞核固缩,核仁不清晰;5min组细胞排列整齐,细胞间隙小,核仁清晰;10min组椎体细胞排列较松散,细胞数量明显减少。正常组和假手术组大鼠前额叶神经元核周间隙正常,核膜连续光滑,细胞器完整,海马神经元核膜光源,核周间隙无改变,细胞器丰富,未见明显自噬小体;5min组核周间隙轻微增宽,粗面内质网轻微扩张,细胞器结构形态较清晰,自噬小体偶见;10min组核周间隙增宽,自噬小体吞噬、清除衰老受损细胞器现象清晰可见多处,粗面内质网明显扩张;15min组大鼠皮质神经元异染色质增多,核固缩,核膜锯齿样,自噬小体少见,细胞破裂内容物易见,海马神经元粗面内质网扩张,线粒体肿胀空泡化,线粒体嵴脱落,锯齿样核膜,高尔基体空泡化。(3)第三部分实验研究发现,正常组、假手术组、5min组、10min组、15min组的Beclin-1蛋白相对表达量服从正态分布(Kolmogorov-Smirnov=0.193,0.221,0.146,0.215,0.251,P=0.200,0.200,0.200,0.200,0.148);经方差齐性检验,方差齐(Levene’s=0.944,P=0.473),组间比较应用LSD检验。各组p62蛋白相对表达量服从正态分布(Kolmogorov-Smirnov=0.184,0.231,0.096,0.194,0.196,P=0.200,0.200,0.200,0.200,0.200);经方差齐性检验,方差不齐(Levene’s=5.729,P=0.000),组间比较应用Dunnett T3检验。各组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量服从正态分布(Kolmogorov-Smirnov=0.106,0.152,0.146,0.249,0.141,P=0.200,0.200,0.200,0.154,0.200);经方差齐性检验,方差不齐(Levene’s=3.497,P=0.006),组间比较应用Dunnett T3检验。与正常组相比,假手术组大鼠海马区的Beclin-1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ表达无明显变化(P=0.1 08,P=1.000,P=0.826);与正常组相比,5min组大鼠海马区的 Beclin-1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ 表达升高(P=0.016,P=0.036,P=0.027),10min 组大鼠海马区的 Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ 表达升高(P=0.000,P=0.000),p62 表达升高(P=0.001),15min 组大鼠海马区 Beclin-1、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ 表达升高(P=0.001,P=0.000,P=0.000)。(4)第四部分实验研究,宫内窘迫HIBD造模后,模型组大鼠走出中央区域时间明显延长(P<0.01),中央区域路程和总路程明显缩短(P<0.01,P<0.05),活动次数明显减少(P<0.01)。而针刺组走出中央区域时间明显缩短(P<0.05),中央区域路程和总路程明显增加(P<0.01,P<0.05),活动次数显著增加(P<0.01)。在定位航行实验中,随着训练天数的增加,各组逃避潜伏期均呈逐渐缩短趋势,组间差异有统计学意义(P<0.001)。在第1～5天,模型组的逃避潜伏期均较正常组明显延长(P<0.05),空间探索实验中第一次穿越平台象限时间显著延长(P<0.01),目标象限停留时间显著缩短(P＜0.01),穿越平台的次数显著减少(P<0.01);而第1～5天的定位航行实验中,针刺组逃避潜伏期均较模型组明显缩短(P<0.05),空间探索实验中第一次穿越平台象限时间明显缩短(P<0.05),目标象限停留时间显著延长(P<0.01),穿越平台的次数明显增多(P<0.05)。与正常组比较,HIBD模型组新生大鼠海马区LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62明显增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001);与HIBD模型组比较,针刺组新生大鼠海马区LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达升高(P＜0.001,P＜0.001),p62表达下降(P<0.001)。假手术组大鼠前额叶神经元核周间隙正常,核膜连续光滑,细胞器完整,海马神经元核膜光源,核周间隙无改变,细胞器丰富,自噬小体偶见;HIBD模型组大鼠皮质神经元异染色质增多,核固缩,核膜锯齿样,自噬小体增多,细胞破裂内容物易见,海马神经元粗面内质网扩张,线粒体肿胀空泡化,线粒体嵴脱落,锯齿样核膜,高尔基体空泡化;针刺组大鼠皮质神经元核膜光滑,细胞器丰富,核周间隙较模型组变窄,自噬小体增多,细胞坏死现象未见,海马神经元粗面内质网轻微扩张,自噬小体增加。结论:HIBD新生大鼠海马神经元有自噬现象和神经元形态变性损伤等表现,证实了缺血缺氧可诱导自噬的发生,同时造成了神经元的损伤甚至坏死。针刺能够修复HIBD导致的神经功能缺损。针刺干预激活并促进了自噬水平,在一定程度上促进了受损神经元的修复。针刺激活自噬,促进了自噬水平,并修复受损神经元。揭示了缺血缺氧环境诱导下的自噬水平不足以修复神经元损伤,而促进进一步的自噬水平有利于神经元损伤的修复。