正常妊娠类似于同种异体移植，携有父系抗原的胚胎在母体内存活直至分娩，实际上是母体对胎儿的免疫耐受;若母体对胎儿发生免疫排斥，则导致妊娠失败，提示母-胎免疫耐受机制在正常妊娠过程中发挥重要作用。阐明这种免疫耐受机制，不仅对生殖免疫，而且对肿瘤免疫及自身免疫病研究均有积极意义。　　母-胎界面主要包括蜕膜基质细胞、滋养细胞及蜕膜免疫活性细胞，其中蜕膜基质细胞及蜕膜免疫细胞来源于母体，而滋养细胞则来源于胎儿，它们之间相互作用，共同参与维持母-胎界面Th2型免疫偏移。其中蜕膜巨噬细胞占蜕膜免疫活性细胞的10％，可参与胚胎植入、胎盘发育及宫颈成熟等生理过程，以维持成功妊娠。　　核因子NF-κB受体活化因子的配体RANKL（又称为TNFSF11，OPGL，TRANCE或ODF），属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，与受体RANK及诱饵受体骨保护索OPG进行相互调控，参与破骨细胞的分化及骨重塑过程。RANKL/RANK在免疫系统亦发挥作用，RANKL及RANK基因突变的小鼠表现为淋巴结缺如，RANKL可促进树突状细胞(DC)的存活，诱导T细胞增殖等作用。母-胎界面存在多种免疫活性细胞，但迄今仍不清楚RANKL在母-胎界面是否发挥作用。　　第一部分 RANKL参与调控蜕膜基质细胞及滋养细胞的生物学行为　　目的：分析RNAKL在人早孕期蜕膜基质细胞及滋养细胞的表达及其调节作用。　　方法：收集人早孕期正常的绒毛与蜕膜组织，应用胰酶消化、密度梯度离心法分离、培养正常人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞(DSCs)。采用RT-PCR、免疫组织化学、流式细胞术，分别检测RANKL在母胎界面的表达。不同浓度的RANKL作用48h后，利用BrdU细胞增殖试剂盒检测蜕膜基质细胞及滋养细胞的增殖能力;采用AnnexinⅤ-FITC/PI检测蜕膜基质细胞的凋亡;及利用Transwell检测滋养细胞的侵袭能力。　　结果：RT-PCR、免疫组化及流式细胞术研究发现，人早孕期蜕膜基质细胞共表达RANKL及其受体RANK; RT-PCR、免疫组化及流式细胞术分析发现，滋养细胞也共表达RANKL及其受体RANK。RANKL以浓度依赖的方式促进蜕膜基质细胞及滋养细胞的增殖;RANKL(100ng/ml)明显抑制蜕膜基质细胞的凋亡;RANKL(100ng/ml)显著促进滋养细胞侵袭。　　结论：RANKL以自分泌方式促进蜕膜基质细胞的增殖，抑制其凋亡;RANKL以自分泌方式促进滋养细胞增殖与侵袭。　　第二部分 RANKL参与调节蜕膜巨噬细胞的功能及表型　　目的：解析母胎界面的RANKL对蜕膜巨噬细胞功能及表型的调节作用。　　方法：利用流式细胞术分析各种蜕膜免疫活性细胞RANK表达水平;比较外周单核细胞与蜕膜巨噬细胞RANK表达水平;根据RANK在巨噬细胞表达与否，区分为RANK+ dMψ与RANK-dMψ两个细胞亚群，进而分析两个细胞亚群的表型差异;免疫磁珠分选蜕膜巨噬细胞，得到较高纯度的巨噬细胞。将蜕膜基质细胞、滋养细胞及蜕膜巨噬细胞共培养，并在其共培养体系加入rhOPG及anti-RANKL中和性抗体作用48h后，流式细胞术分析蜕膜巨噬细胞表面协同刺激分子CD80、CD86的表达;ELISA检测蜕膜巨噬细胞分泌IL-10、IL-12及IL-23的水平。经过蜕膜基质细胞及滋养细胞的RANKL训导蜕膜巨噬细胞与同种蜕膜naive T细胞共培养5d后，Bioplex检测IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的分泌水平。　　结果：流式细胞术分析发现，蜕膜巨噬细胞表面表达较高水平的RANK，并且RANK在蜕膜局巨噬细胞的表达水平明显高于外周单核细胞。与RANK-dMψ比较，RANK+ dMψ表面表达较高水平的CD206、CD209及CD11c，表现为M2型，即耐受型巨噬细胞。滋养细胞及蜕膜基质细胞来源的RANKL降调节蜕膜巨噬细胞表面协同刺激分子CD80、CD86的表达水平;促进蜕膜巨噬细胞分泌IL-10，抑制分泌IL-12、IL-23。被蜕膜基质细胞及滋养细胞训导的蜕膜巨噬细胞可诱导蜕膜na(i)ve T细胞分泌高水平的IL-4、IL-10，并抑制TNF-α及IFN-γ的分泌。　　结论：RANK+ dMψ表面表达较高水平的CD206、CD209及CD11c，呈现为M2耐受型巨噬细胞;蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL可诱导蜕膜巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞;经过蜕膜基质细胞及滋养细胞表达的RANKL洲导蜕膜巨噬细胞可介导同种蜕膜na(i)ve T细胞分化为Th2型细胞，使母-胎界面呈现Th2型免疫优势。　　第三部分 RANKL调控蜕膜巨噬细胞表型的分子机制　　目的：解析RANKL调控蜕膜巨噬细胞功能及表型的分子机制。　　方法：将滋养细胞、蜕膜基质细胞与蜕膜巨噬细胞共培养，并在共培养体系中加入rhOPG或anti-RANKL中和性抗体处理后，利用Phosflow流式细胞术检测蜕膜巨噬细胞活化的信号通路如PI3k/Akt、STAT6等;采用实时定量real-timeRT-PCR检测共培养后蜕膜巨噬细胞转录因子IRF4、Jmjd3的表达;利用质粒pCDNA3.1(+)-RANKL过表达蜕膜基质细胞及滋养细胞肿瘤细胞系JEG-3细胞，成功实现蜕膜基质细胞及滋养细胞过表达RANKL。蜕膜基质细胞及JEG-3细胞过表达RANKL后，与蜕膜基质细胞共培养，并在共培养体系中加入PI3K/Akt特异性抑制剂Ly294002，ELISA检测IL-10、IL-12及IL-23的分泌水平;real-timeRT-PCR检测巨噬细胞表型相关转录因子IRF4、Jmjd3 mRNA的表达。　　结果：滋养细胞及蜕膜基质细胞与蜕膜巨噬细胞共培养后，RANKL通过与蜕膜巨噬细胞表面的RANK结合，激活Akt(pS473)分子，进而活化下游STAT6分子，启动M2型巨噬细胞相关转录因子IRF4、Jmjd3 mRNA的转录，使巨噬细胞表现为M2巨噬细胞表型。蜕膜基质细胞及JEG-3细胞过表达RANKL后，可活化巨噬细胞PI3K/Akt信号通路，促进IRF4、Jmjd3 mRNA的转录，增加IL-10的分泌。　　结论：蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL通过活化PI3K/Akt信号分子，进而活化STAT6分子，促进M2型巨噬细胞相关转录因子IRF4、Jmjd3 mRNA的转录，诱导蜕膜巨噬细胞向M2耐受型巨噬细胞分化。　　第四部分母-胎界面RNAKL表达下降导致巨噬细胞M1型偏移及自然流产　　目的：利用动物实验验证母-胎界面RANKL表达异常对蜕膜巨噬细胞功能及妊娠结局的作用。　　方法：建立正常妊娠小鼠模型及自然流产小鼠模型，在小鼠孕5天及孕9天原代分离得到小鼠蜕膜免疫活性细胞，利用流式细胞术分别分析孕5天及孕9天小鼠蜕膜巨噬细胞RANK表达水平;并分析正常妊娠小鼠及流产小鼠蜕膜巨噬细胞表面CD80、CD86、CD206及MHC-Ⅱ类分子的表达水平。在正常妊娠小鼠孕3天时给予手术处理，分别给予宫角注射anti-RANKL中和性抗体及抑制剂Ly294002，术后4天观察小鼠胚胎吸收率，流式细胞术分析两侧子宫蜕膜巨噬细胞表而CD80、CD86、CD206及MHC-Ⅱ类分子的表达情况。　　结果：孕5天时，正常妊娠小鼠蜕膜巨噬细胞表面RANK的表达明显高于流产小鼠;孕9天，正常妊娠小鼠蜕膜巨噬细胞表面RANK的表达仍明显高于流产小鼠。孕9天，流产小鼠蜕膜巨噬细胞表而MHC-Ⅱ类分子显著高于正常妊娠孕鼠，但协同刺激分子CD80、CD86无明显差异。在正常妊娠孕鼠，anti-RANKL中和性抗体处理，4天后一侧子宫蜕膜巨噬细胞表达CD80、CD86的水平明显高于对侧vector处理组。anti-RANKL中和性抗体处理组的胚胎吸收率均明显高于vector处理组。　　结论：母-胎界面RANKL降调节可导致蜕膜巨噬细胞分化为M1型及不良妊娠结局。　　综上所述，本研究发现人早孕期蜕膜基质细胞及滋养细胞表达RANKL及其受体RANK，并在母-胎界面发挥以下作用:(1) RANKL以自分泌方式促进蜕膜基质细胞增殖，抑制其凋亡;(2) RANKL促进滋养细胞增殖与侵袭;(3)蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL抑制蜕膜巨噬细胞表达CD80、CD86，促进IL-10的分泌，抑制IL-12、IL-23的分泌，表现为M2耐受型巨噬细胞;(4)经过蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL训导的蜕膜巨噬细胞，可诱导蜕膜na(i)ve T细胞分化为Th2型，利于母-胎界面形成Th2型免疫优势;(5)蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL通过活化蜕膜巨噬细胞内PI3K/Akt及STAT6信号通路，促进M2型巨噬细胞转录因子IRF4、Jmjd3 mRNA的表达，调节蜕膜巨噬细胞的表型;(6)母-胎界面RANKL降调节，则导致蜕膜巨噬细胞向M1型分化及自然流产的发生。因此，母-胎界面的RANKL作用于蜕膜巨噬细胞，在母-胎界面产生利于妊娠的免疫耐受微环境。