【摘 要】
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多杀菌素是从刺糖多孢菌的发酵液中提取到的次级代谢产物,被开发为新型杀虫剂,既有作为生物农药的低毒性、环境友好的特点,又能像化学农药一样高效、快速发挥作用,在国内外害虫防治方面具有广阔应用前景。由于多杀菌素的生产方式是微生物发酵生产,目前其产量较低、成本较高,限制了其大规模广泛应用。要想通过选育高产菌株及优化发酵工艺的方法来提高其产量,首要的就是要构建快速、高通量的多杀菌素检测方法。生物传感器通过将
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多杀菌素是从刺糖多孢菌的发酵液中提取到的次级代谢产物,被开发为新型杀虫剂,既有作为生物农药的低毒性、环境友好的特点,又能像化学农药一样高效、快速发挥作用,在国内外害虫防治方面具有广阔应用前景。由于多杀菌素的生产方式是微生物发酵生产,目前其产量较低、成本较高,限制了其大规模广泛应用。要想通过选育高产菌株及优化发酵工艺的方法来提高其产量,首要的就是要构建快速、高通量的多杀菌素检测方法。生物传感器通过将识别元件与靶标的结合变化转导为可测信号输出,实现对靶标的快速检测。其中,核酸适配体因其亲和性强、易于合成等特点,成为一种很好的识别元件,是生物传感器的重要组成部分。本研究以多杀菌素为靶标,利用磁珠-SELEX技术筛选出识别多杀菌素的核酸适配体,然后基于该核酸适配体分别建立了电化学适体传感器、一次性适体传感器和荧光适体传感器,为多杀菌素的快速检测提供了多种方法。（1）基于磁珠-SELEX法筛选多杀菌素的核酸适配体,并进行测序、鉴定。以多杀菌素为研究对象,设计随机单链DNA文库,固定在链霉亲和素磁珠上,构建基于磁珠的SELEX筛选方法。结合Q-PCR技术,经过六轮筛选得到富集文库,对文库进行高通量测序得到7000余条序列。根据序列的富集情况和序列组成等选出48条候选序列,对这些序列进行系统发育树分析,再利用等温滴定量热技术进行亲和力鉴定。结果显示,06号和11号核酸适配体有热量反应,解离常数分别为518e-6±27.3e-3 M和70.1e-6±612e-6 M,11号核酸适配体的亲和力更强选为最优核酸适配体。（2）构建基于普通金电极的电化学适体传感器。将巯基标记在11号核酸适配体的5’端,自组装在金电极上,滴加6-巯基己-1-醇防止单链DNA倒伏和非特异性吸附,制备得到工作电极。构成三电极体系,利用差分脉冲伏安法对电信号进行检测。通过优化核酸适配体的浓度和自组装时间成功构建了电化学适体传感器,在10-2～102 nmol/L的浓度范围内,峰电流差值与多杀菌素浓度的对数值呈良好的线性关系,检出限为0.01 nmol/L。（3）设计双链探针,构建基于丝网印刷电极的一次性适体传感器。根据11号核酸适配体序列的二级结构设计双链探针,解决了单链DNA存在的分布不均匀、易倒伏的问题。在核酸适配体的5’端和配对引物的3’端分别修饰巯基,通过互补配对形成双链探针,再将其固定在纳米金印刷电极上,用方波伏安法进行电化学检测。通过优化双链探针的浓度和结合温度成功构建了一次性适体传感器,在10-1～104 nmol/L的多杀菌素浓度范围内,峰电流的差值与多杀菌素浓度的对数值呈线性关系,检出限为0.1 nmol/L。（4）构建基于氧化石墨烯的荧光适体传感器,并利用核酸酶实现信号循环放大。在核酸适配体的3’端修饰FAM荧光基团,加入氧化石墨烯（GO）吸附核酸适配体,猝灭荧光;再加入多杀菌素靶标,靶标与核酸适配体形成复合物游离至溶液中,荧光信号得以恢复,过程中利用酶标仪检测荧光信号。通过优化GO浓度、猝灭时间和响应时间成功构建了荧光适体传感器,多杀菌素浓度为1～100μmol/L范围内,荧光强度信号和多杀菌素浓度呈良好的线性关系,检出限为1 μmol/L。引入DNase I进行靶标循环信号放大后荧光强度恢复更加明显,比之前高出一倍左右,检出限低至100 nmol/L,荧光适体传感器的灵敏度提高。
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