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灵芝(Ganodermalucidum)是一种名贵食药用真菌,其药理作用来源于它的次生代谢产物。提高灵芝次生代谢产物的生物合成以及解析次生代谢产物合成调控机制是灵芝研究的重要方向。先前的研究发现热胁迫可以显著提高灵芝的主要药用次生代谢产物灵芝酸(ganodericacid,GA)的含量。然而,灵芝细胞如何响应热胁迫进而促进GA生物合成的分子机制却并不清楚。细胞膜甘油磷脂是细胞膜的结构基础,也是细胞与外界联系的第一道屏障,在响应环境改变、信号转导和物质代谢等方面发挥着重要调控作用。然而,在微生物中,甘油磷脂介导的脂类信号分子如何响应环境改变还知之甚少。在本研究中,我们以药用真菌灵芝为研究材料,解析细胞膜甘油磷脂在响应热胁迫及调控GA生物合成中的作用,主要研究结果如下:1.在热胁迫下,菌丝胞内GA含量显著升高约1.7倍,并且细胞膜流动性也显著升高。在非热胁迫下,外源添加降低膜流动性的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)导致GA含量降低;外源添加升高膜流动性的苯甲醇(benzyl alcohol,BA)导致GA含量升高。并且,在热胁迫下,DMSO预处理灵芝菌丝时,热胁迫诱导的GA含量升高恢复至非热处理时的GA含量。以上结果初步表明,膜流动性正调控GA生物合成,且热胁迫诱导的GA生物合成依赖流动性升高。进一步研究发现,沉默D9des基因能够降低脂肪酸不饱和度从而降低膜流动性,导致D9des沉默菌株中GA含量下调约25%,且在D9des沉默菌株中外源添加BA处理时,其GA含量恢复到WT水平;相反,过表达D9des基因能够增加脂肪酸不饱和度从而增加膜流动性,导致GA含量上调1.2倍,且在D9des过表达中外源添加DMSO处理时,其GA含量恢复到WT水平。最后,分析热胁迫下WT和D9des基因沉默菌株的GA含量发现,热胁迫处理D9des基因沉默菌株导致其GA含量显著升高1.3倍,该结果表明,通过沉默D9des基因降低流动性,抑制了热胁迫诱导的GA生物合成。该研究首次在丝状真菌灵芝中证明,热胁迫诱导的GA生物合成依赖流动性升高。2.为了进一步研究甘油磷脂在热胁迫诱导GA生物合成中的作用,本论文系统地检测了热胁迫不同时间后(0,5,15,30,45和60 min),六大类甘油磷脂的含量变化。结果发现,热胁迫下,磷脂酸(phosphatidic acid,PA)含量显著升高,磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)含量显著降低。在热胁迫处理15 min时,PA含量显著升高约3.0倍;在热胁迫处理30 min时,PE含量显著降低约60%。进一步测定磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的酶活发现,热胁迫处理30 min时,PLD酶活显著升高约2.1倍。通过构建pld基因的沉默转化子发现,沉默pld基因后,热胁迫导致的PA含量升高和PE含量降低受到抑制,以上结果表明,热胁迫下,PLD分解PE形成PA。进一步研究PLD和PA在热胁迫诱导GA生物合成中的调控作用发现,在热胁迫下,不同浓度的正丁醇预处理灵芝菌丝,能够抑制热胁迫诱导的GA含量升高,并且,当外源添加50μg/100 ml PA处理时,菌丝中GA含量显著升高约1.3倍。进一步,热胁迫能够诱导pld沉默菌株的GA含量显著升高约1.5倍,并且pld沉默菌株在热胁迫下的GA含量显著低于WT菌株;在热胁迫下,在pld基因沉默转化子中外源添加PA时,GA含量可恢复到WT水平。综合以上结果表明,热胁迫激活PLD产生的第二信使PA,调控了热胁迫诱导的GA生物合成。该研究结果展示了灵芝细胞通过PLD和PA介导的磷脂信号调控次生代谢产物GA的生物合成。3.甘油磷脂的测定结果中还发现,热胁迫下,磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)含量也出现显著积累,这一结果暗示肌醇磷脂信号可能参与热胁迫响应并发挥信号转导作用。通过研究发现,在热胁迫下,磷脂酰肌醇4激酶(Phosphatidylinositol 4-kinase,PI4K)和磷脂酰肌醇 4 磷酸 5 激酶(Phosphatidylinositol 4-phosphate-5-kinase,PIP5K)酶活以及相应的产物磷脂酰肌醇4磷脂(Phosphatidylinositol 4-phosphate,PI4P)和磷脂酰肌醇 4,5 二磷脂[phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PI(4,5)P2]含量都显著升高。具体表现为,在热胁迫处理20 min和10 min时,PI4K和PIP5K酶活分别达到最高,分别升高约3.7倍和5.6倍;在热胁迫处理20 min时,PI4P和PI(4,5)P2含量达到最高,分别显著升高约1.3倍和8.6倍。进一步试验表明,在热胁迫下预处理肌醇单磷酸酶的抑制剂LiCl抑制PI合成时,抑制了热胁迫诱导胞内钙离子浓度和GA含量升高,并且该抑制作用可以被外源添加PI或PI4P去除。在热胁迫下预处理PI4K抑制剂wortmanin或沉默pi4k基因时,也能够抑制热胁迫诱导胞内钙离子浓度和GA含量升高,但该抑制作用可以被外源添加PI4P去除,而不可被外源添加PI去除。然而,当沉默pip5k基因时,热胁迫诱导的胞内钙离子浓度和GA含量升高也被抑制,但该抑制作用不可被外源添加PI4P去除。综合以上结果表明,热胁迫激活PI4K和PIP5K,进而磷酸化PI先后形成PI4P和PI(4,5)P2,阻断该磷酸化反应则抑制了热胁迫诱导的胞内钙信号,以及钙信号下游的GA生物合成。