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目的:mig-14是沙门菌属通过水平转移获得的外来毒力基因,其产物蛋白Mig-14在沙门菌属拮抗多粘菌素B杀伤的过程中扮演着重要的角色。并且作为一种调节因子,Mig-14可调控多种基因表达。但是,对于mig-14的表达机制与特性仍然未明。本研究旨在探索不同环境中伤寒沙门菌中mig-14基因的表达特性。方法:1.伤寒沙门菌缺失变异株的制备使用自杀质粒法,利用同源重组的原理,分别制备伤寒沙门菌调节因子Hil D、Him A、Him D、Ydg T、Hha、HNS的缺失变异株,Fis及Omp R缺失变异株由实验室保存。2.q RT-PCR分析mig-14转录水平采用实时定量PCR技术,观察伤寒沙门菌野生株及各缺陷变异株中mig-14基因的转录水平。普通LB(Luria-Bertani培养基)培养条件下,比较伤寒沙门菌野生株及ydg T、hha、hns缺失变异株中mig-14基因的转录水平,从而判断mig-14作为伤寒沙门菌水平转移获得的外来基因,其转录是否被沉默蛋白(Ydg T、Hha、HNS)抑制;多粘菌素B(polymyxin,PB)刺激条件下,比较伤寒沙门菌野生株及hil D、him A、him D、fis、omp R缺失变异株中mig-14的转录水平,从而判断mig-14在PB存在的情况下,其转录是否由调节因子Hild、Him A、Him D、Fis、Omp R激活。3.Western blot免疫印迹法检测Mig-14表达水平实验室存有Mig-14兔多克隆抗体,收集伤寒沙门菌及各缺失变异株全菌蛋白,以Mig-14兔多克隆抗体进行Western blot免疫印迹实验从而分析Mig-14在各菌株中的表达情况。4.lacZ融合实验构建mig-14启动子区域的lacZ基因融合质粒pHRP309。PCR扩增mig-14启动子区域,与含β-半乳糖苷酶基因(lac Z)的质粒载体p HRP309连接构建mig-14启动子-lac Z融合质粒。将融合质粒导入伤寒沙门菌野生株和各缺失变异株中,细菌胞内的β-半乳糖苷酶活性即可表示mig-14的转录表达水平。裂解细菌,收集上清,测定β-半乳糖苷酶活性,以Miller Units表示。5.蛋白表达及纯化利用大肠杆菌BL21系统,分别表达纯化沉默蛋白HNS以及宿主整合因子IHF的α亚基Him A,以进一步分析调节因子对mig-14的调控作用。6.凝胶阻滞实验(EMSA)通过体外凝胶阻滞实验(EMSA)分析调节因子HNS、Him A对mig-14表达的调节机制。7.分析IHF、Mig-14对iagA的影响构建伤寒沙门菌的himA/mig-14双基因缺失变异株,构建him A和mig-14的p BAD33异源表达载体,双缺失变异株分别回补him A和mig-14后,观察高渗早期iag A基因的转录情况。结果:1.伤寒沙门菌基因缺失变异株的制备成功制备伤寒沙门菌hil D、him A、him D、hha及ydg T的缺失变异株,并经序列鉴定分析验证;伤寒沙门菌hns的缺失变异株构建失败,遂通过构建伤寒沙门菌hns高表达株反向分析HNS对mig-14的抑制。2.普通LB培养条件下沉默蛋白抑制mig-14转录利用实时定量PCR(q RT-PCR)比较伤寒沙门菌野生株及hha、ydg T缺失变异株及hns高表达株中的mig-14的转录水平。结果显示hha、ydg T缺失变异株中mig-14转录水平明显高于伤寒沙门菌野生株,且缺失了hha后mig-14转录水平上升明显高于ydg T缺失变异株。另外,伤寒沙门菌GIFU10007的hns基因无法敲除,故通过构建hns高表达菌株来反映HNS对mig-14的抑制作用。结果显示,伤寒沙门菌hns高表达菌株的mig-14转录水平明显低于野生株。这表明,沉默蛋白HNS、Hha、Ydg T抑制外来基因mig-14的转录表达。3.PB刺激下野生株及各缺失变异株中mig-14转录水平PB可刺激mig-14表达。实时定量PCR及lac Z融合实验结果均显示:在PB刺激下,伤寒沙门菌的hil D、him A、him D、fis、omp R缺失变异株同野生株相比,mig-14转录表达水平均明显下降。结果表明,在PB刺激下,伤寒沙门菌调节因子Hil D、Fis、IHF(Him A/Him D)、Omp R均参与激活mig-14。4.Western blot免疫印迹法检测Mig-14表达水平利用实验室前期工作制备的Mig-14兔多克隆抗体,检测各菌株中Mig-14表达水平。结果发现伤寒沙门菌mig-14缺失变异株及野生株在目的条带处(Mig-14大小约36.5 KD)无明显差异条带,故认为Mig-14兔多克隆抗体失效。5.成功表达伤寒沙门菌HNS蛋白及IHF的α亚基Him A成功构建p ET28a-HNS、p ET15b-Him A及p ET15b-Him D表达载体,利用大肠杆菌BL21表达系统,成功表达并纯化得到HNS及Him A蛋白(Him D形成包涵体,尝试多次后均无法得到有效活性形式)。6.凝胶阻滞实验(EMSA)结果显示,HNS及Him A都能与mig-14基因的启动子区域结合,形成DNA-蛋白复合物,延缓DNA迁移速率。这也意味着,调节因子HNS及Him A能直接作用于mig-14的启动子区域发挥调节作用。7.高渗早期宿主整合因子(IHF)激活mig-14表达可增加iagA的转录成功构建伤寒沙门菌him A/mig-14双缺失变异株。分别回补him A和mig-14后发现,在高渗早期,回补him A后,iag A转录水平同双缺陷相比明显上升;而回补mig-14后,iag A转录水平同双缺陷相比并无明显统计学差异。结果表明,高渗早期,IHF激活mig-14与iag A,Mig-14也能激活iag A,但Mig-14发挥激活iag A的作用依赖IHF的存在。结论:mig-14作为伤寒沙门菌水平转移获得的外来基因,其表达受沉默蛋白HNS、Hha、Ydg T抑制;多粘菌素B刺激下,调节因子Hil D、Fis、IHF(Him A/Him D)、Omp R均参与激活mig-14的转录表达。沉默蛋白HNS及宿主整合因子(IHF)的α亚基Him A能直接与mig-14的启动子结合,调节mig-14转录。本实验室前期工作发现Mig-14在高渗早期大量表达并能影响SPI-1上基因的表达,本次工作发现Mig-14在高渗早期对iag A及下游致病岛1的调节作用依赖于宿主整合因子(IHF)。这些证据初步揭示了Mig-14作为一种新的调节因子在复杂的细菌调节网络中的角色。