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目的在4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4-NQO)诱导C57BL/6鼠食管鳞癌模型的基础上,丝线结扎小鼠上颌第二颗磨牙和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)口腔涂抹建立鼠牙周炎模型,确定P.gingivalis在4-NQO诱导鼠食管鳞癌起始阶段和癌前病变进展过程中的作用,并探讨P.gingivalis在该模型鼠食管鳞癌发生和发展过程中的分子机制,鉴定关键分子及信号通路,为食管鳞癌的防治奠定理论基础。方法1 C57BL/6鼠随机分成对照组(包括空白对照组和溶剂对照组)、P.gingivalis感染组、4-NQO组、4-NQO联合P.gingivalis组、4-NQO联合抗生素组、4-NQO联合P.gingivalis和抗生素组,每组30只,共210只。甲硝唑(0.2g/L)、新霉素(0.2 g/L)、氨苄青霉素(0.2 g/L)和万古霉素(0.1 g/L)等4种抗生素预处理两周,50μg/m L的4–NQO处理相应实验组鼠8周后,鼠口腔上颌第二磨牙丝线结扎、P.gingivalis口腔涂抹感染建立鼠牙周炎模型。2为观测食管黏膜病变进展,22周、26周、30周和34周时,各组鼠称重,前3个时间点分别处死各组鼠6只,34周处死12只。鼠食管组织沿纵轴剖开、伸展、固定、拍照,检测鼠食管黏膜病变、食管黏膜拭子取样;3只鼠食管固定、石蜡包埋、切片、HE染色,镜下观察病理变化,3只鼠食管组织-80℃保存,RNA提取和转录组测序分析,34周时,剩余小鼠按上述方法处理。3提取冻存食管组织RNA并组内制备混合样本,RNA建库并质检、定量后,Illumina测序仪进行测序分析,测序原始数据过滤后比对至鼠参考基因组,获得转录本信息,并进行基因表达定量、GO和KEGG Pathway分析。4 Adobe Photoshop图像处理软件对食管黏膜表面病变进行选取,计算病变面积及发病率。5免疫组化采用中杉金桥PV-9000试剂盒,切片脱蜡、水化、非免疫血清封闭、3%过氧化氢溶液孵育、抗原修复,一抗4℃孵育过夜,所用一抗包括:Ki67(1:500,CST,12202T)、p-Stat3(1:200,CST,9145P)、COX-2(1:500,CST,12282)、p H2AX(1:500,CST,80312),一抗过夜孵育,DAB显色、苏木素复染。6将RNA反转录为c DNA,q PCR检测IL-6、cyclin D1、IL-1β、TNF-α、INF-γ、c-Myc等m RNA分子表达变化。7统计学方法:统计学分析均采用SPSS 17.0统计学软件分析,各组肿瘤面积、分子表达变化比较采用t检验或单因素方差分析,检验水准为P<0.05。结果1实验过程中对照组鼠体重无显著变化(29.75 g),但其它各组鼠在22–34周期间,体重逐渐降低,4-NQO联合P.gingivalis组降低最明显(23.5 g),其它各组鼠体重在二者之间(27.78 g)。2自22周,4-NQO组和4-NQO联合P.gingivalis组鼠食管黏膜上皮开始发生病变,肉眼为黏膜表面粗糙,灶性颗粒状或乳头状增生,随时间进展,灶性颗粒状病变相互融合,病变面积逐步增大,食管壁增厚,镜下为不同程度的基底细胞增生、不典型增生、鳞状细胞癌等病变。34周时,食管黏膜肉眼和镜下病变严重程度依次为4-NQO联合P.gingivalis组、4-NQO组、抗生素治疗组,对照组和P.gingivalis组食管黏膜仍然呈现正常外观。3 4-NQO联合P.gingivalis组中,P.gingivalis阳性组鼠食管鳞癌发病率(100%,6/6)高于阴性鼠(40%,2/5),食管黏膜病变面积分别为10.56mm~2、2.27mm~2(P<0.05);4-NQO组食管癌发病率54.5%(6/11)和食管黏膜病变面积(4.26 mm~2)低于P.gingivalis阳性鼠,与联合处理组中的P.gingivalis阴性鼠无明显差异;其它各组鼠食管无鳞癌发生,抗生素治疗明显降低食管黏膜病变发生率和病变负荷。4 P.gingivalis联合4-NQO组鼠食管组织癌前病变和癌组织中,p Stat3、c-Myc、COX-2、Ki67、p H2AX等蛋白表达最高并具有统计学差异,4-NQO组表达中等,其它各组呈弱阳性表达;细胞周期相关蛋白Cyclin D1在4-NQO组和联合组鼠食管组织中表达明显高于其它各组。5 P.gingivalis诱导4-NQO处理鼠食管组织中IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、等炎症相关因子表达上调,这些因子在其它各组间表达无明显差异。6与对照组相比,P.gingivalis组、4-NQO组和联合组鼠食管组织中差异表达基因的个数依次增多,分别为112、1072、1654;4-NQO诱导的差异表达基因主要富集于炎症、免疫反应、细胞紧密连接、多个信号通路紊乱等,P.gingivalis感染进一步加剧了4-NQO诱导的免疫反应和炎症反应。结论1 P.gingivalis感染促进了4-NQO诱导的鼠食管鳞癌早期病变的形成和进展;2 P.gingivalis诱导的食管组织中多个炎症因子介导的炎症微环境参与4-NQO诱导的鼠食管黏膜癌前病变及其恶化,其中IL-6/Stat3信号通路激活可能是食管鳞癌发生发展过程的关键信号分子。