Nnat是一个脑特异表达的新基因,在大脑发育过程中被选择性地表达。该基因的全长cDNA最初在小鼠胎脑中被克隆,随后又克隆了人Nnat基因的全序列。人Nnat基因全长3973bp,含有三个外显子和两个内含子。Nnat mRNA有α和β两种剪接形式,前者编码81个氨基酸,后者编码54个氨基酸,两者具有相同的开放阅读框,差别在于β形式中间的外显子被剪切掉。人Nnat是单拷贝基因,定位于染色体20q11.2-12。小鼠Nnat基因定位于2号染色体末端。该基因是印记基因(imprinted gene),仅在父本来源的等位基因表达,而母本来源的等位基因则被甲基化不能表达。该基因在胚胎期及出生后早期大量表达,而在成年和衰老大脑中表达明显降低,因此推测该基因与大脑的发育与分化密切相关。除了在正常脑中检测到Nnat基因的表达外,在部分肿瘤及非神经组织中也检测到它的表达,但其确切功能目前还不清楚。本研究采用生物信息学分析、基因转染技术、流式细胞仪技术、免疫荧光技术、RT-PCR及RNA干扰等技术，得到了以下结果： 1.采用生物信息学方法进行了Nnat核酸和蛋白质相关分析,发现Nnat在人、小鼠、大鼠、猕猴、黑猩猩、牛、猪和狗有同源序列,而在其它物种中未查到同源序列。NetPhos服务器进行蛋白磷酸化分析,没发现任何磷酸化位点；PSORT蛋白定位分析结果认为内质网定位的可能性为44.4％,细胞质定位为22.2％,SMART服务器分析Nnat蛋白N端有信号肽和跨膜区。SAGE谱显示,该基因在成神经管细胞瘤、室鼓膜瘤、间皮瘤、横纹肌肉瘤中呈高表达；在星形胶质细胞瘤、眼癌中呈中度表达；在正常大脑皮层、视网膜、胎盘、脊髓、胚胎干细胞和腹膜中呈低表达。 2.构建重组载体,利用基因转染技术,使用荧光显微镜观察发现在HepG2细胞中表达Nnat/EGFP,两种融合蛋白都具有细胞质内定位方式,在C6转染细胞中使用G418药物筛选获得稳定表达Nnat的细胞克隆。流式细胞仪检测细胞生长周期,三种细胞无明显差异,也未观察到表达Nnat/EGFP的C6细胞发生明显凋亡。 3.使用RT-PCR检测到Nnat基因在胚胎期大脑,从E9已开始表达,但表达量较低,随着发育时间的增加,Nnat mRNA的表达量逐渐增加,出生前后表达量最高。出生后无论是在大脑还是小脑中,Nnat mRNA表达都是随发育时期的增加,呈明显下降趋势,并在P60降到最低。 4.免疫组织化学染色发现,Nnat蛋白在大脑的外囊,胼胝体,大脑深自质,背侧海马联合,扣带束等处高表达,而在大脑皮层,海马,尾壳核,丘脑等处低表达或没有表达。Nnat蛋白表达阳性部位呈束状排列,内部有纤维状染色,周围有胶质细胞包绕。Nnat蛋白可能是髓鞘相关蛋白。 5.RNA干扰PC12细胞Nnat的表达后,细胞的形态发生明显变化,由无规则的多角形或长梭形变为有规则多角形或圆形,且细胞与细胞间的界限清晰,长出尖细的突起,细胞集落消失,呈散在生长。但免疫组化并没有检测到神经系统标记基因的明显变化。 6.RNA干扰能促进NGF诱导下PC12细胞突起生长。野生PC12在NGF作用6h以后细胞开始长出神经突起,至48h时细胞变得扁平,呈梭形或多角形,胞体增大,部分细胞长出突起,突起长度约为胞体直径一半左右,细胞分化不均,部分细胞没有明显的形态变化。RNAi PC12细胞在NGF作用6h可观察到细胞折光度发生改变,突起部位明显延伸,至48小时细胞几乎全部有长的突起长出,每个细胞周围有3～5个突起,突起上有分支,突起长度约为胞体直径2倍以上,个别长的突起能达到细胞直径的5倍左右,细胞分化程度基本相同,很少看到无突起的细胞。NGF诱导后突起增长比例相对于对照的PC12细胞明显增高,说明RNA干扰可促进NGF诱导下细胞的突起生长。 通过对Nnat蛋白在真核细胞中异位表达情况和正常生理条件下大鼠脑中的表达特征的观察,为Nnat分子功能研究提供了有价值的线索,并通过研究RNA干扰对细胞表型变化的影响,为Nnat在神经系统中功能的明确做了有益的积累,进一步拓宽了对Nnat分子在中枢神经系统中功能的认识。