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硼(B)毒害是近年我国南方柑橘产区由于B肥施用不当引起的生理性病害,严重影响当地柑橘的栽培生产。本研究利用沙培法,以不同B水平处理(对照:10μMH3BO3;B毒害:400μMH3BO3)的雪柑(Citrus sinensis)和酸柚(C.grandis)实生苗为试验材料,结合细胞生物学与分子生物学研究手段研究B毒害处理对柑橘根叶显微结构以及体内B分布,叶片miRNA表达和根尖miRNA表达等的影响,并在此基础上对B毒害响应miR397a如何影响叶片维管组织B转运的生物学机制展开系统研究和探讨。旨在阐述柑橘B毒害的发生机理和柑橘miRNA响应B毒害的分子调控机制,为B肥的合理使用和柑橘高优栽培提供科学依据。主要结果如下:1 B毒害处理对柑橘根、叶显微结构以及体内B分布的影响采用沙培法进行柑橘长期B毒害处理,发现B毒害症状只发生在酸柚叶片中;B毒害显著影响酸柚植株地上部和地下部生物量、叶片光合生理指标以及叶绿素荧光,但对雪柑没有显著影响;表明雪柑比酸柚更耐受B毒害。B毒害主要作用于柑橘叶片维管组织,引起不耐B毒酸柚韧皮组织细胞程序性死亡(PCD)。B毒害处理显著增加柑橘叶片总B含量,但耐B毒雪柑叶片总B含量与不耐B毒酸柚片总B含量没有显著差异;半定量qPCR显示B毒害柑橘叶片中的BOR1几乎不表达,NIP5;1的表达量没有显著变化,而BOR4在B毒害雪柑和酸柚中的表达量均略有上升,但两者之间没有显著差异;表明柑橘可能具有不依赖于"外排转运"的耐B毒机制。2 柑橘叶片miRNA对B毒害的响应通过高通量测序,本研究从B处理酸柚和雪柑叶片中共发现699个候选miRNA(387个保守miRNA,312新miRNA)。B毒害分别引起酸柚和雪柑叶片中51个(25个上调,26个下调)和20个(16个上调,4个下调)miRNA发生差异表达。Stem-loop qRT-PCR显示,miRNA395a和miR397a是酸柚叶片中上调表达最为显著的2个miRNA,但它们在雪柑中均发生下调表达。通过RLM-5’-RACE,本研究确认了 miR397a靶向剪切LAC4和LAC17。进一步的细胞化学研究显示,miR397a在酸柚叶片中上调表达降低了LAC 和LAC17的表达水平并抑制了木质部细胞壁的次生发育,而在雪柑叶片中的抑制表达引起LAC4上调并引起木质部细胞壁在纹孔附近产生次生沉积。结合前期研究结果,本研究表明,miR397a通过靶向调控LAC4和LAC17参与木质部细胞壁次生代谢,可能降低B由木质部向韧皮部的转运从而缓解B对韧皮部的毒害。3 B毒害响应miR397a靶向LACs调控木质素次生合成对维管组织B转运的影响基于mRNA原位杂交、细胞化学定位和原位检测分析技术,本研究发现miR397a及其靶基因在木质部特异性表达;B毒害导致雪柑LAC4在后生木质部上调表达;引起木质素经高尔基器介导的囊泡转运在后生木质部细胞壁大量积累;有效地限制了 B由木质部向韧皮转运并降低了韧皮部的B水平。结合前期研究结果,本文提出了柑橘耐B毒害的一个新模型:耐B毒柑橘通过抑制木质部miR397a表达,靶向上调LAC4促进木质部中木质素的次生合成,将蒸腾流中的B截留在木质部中,减少自由态B在韧皮组织中积累并降低韧皮组织的B水平从而缓解B过量对韧皮部产生毒害作用。4 柑橘根尖miRNA对B毒害的响应应用HiSeq2500高通量测序,本研究从B毒处理酸柚和雪柑根尖中共分离鉴定了 172个miRNA(5个为柑橘已知miRNA,167个为新的候选miRNA),其中37个miRNA的表达量在酸柚根尖中显著改变,但仅有11个在雪柑根尖中发生明显变化。结合qRT-PCR检测和RLM-5’-RACE 验证,最终确定 Ciclev10000756m.g.v1.0,Ciclev10018916m.g.v1.0和Cicev10003452m.g.v1.0 分别被 miR319、miR171家族多个成员和miR396g-5p介导剪切。生物信息学分析表明Ciclev10000756m.g.v1.0编码的MYB类似蛋白与AtMYB61具有同源性,而AtMYB61参与拟南芥的侧根形成。结合解剖学研究结果,不耐B毒酸柚可能存在如下长期B毒害的适应性调节机制:B毒害对植株地上部造成的伤害通过营养胁迫的方式向根系传递信号,根尖接收信息并上调miR319的表达,靶向下调MYB并抑制侧根的形成,有限度地降低根系对B的吸收与转运,从而改善植株地上部在长期B毒害胁迫下的生长。