柠檬酸作为生产量最大的有机酸,广泛应用于食品、医药、洗涤剂和化妆品等领域。柠檬酸主要以黑曲霉为宿主进行工业化生产,目前产量和产率已经达到较高水平,需要开发新的生产方式和生产工艺,以提高柠檬酸产量。大肠杆菌生长快速、培养简单的特点弥补了黑曲霉的缺陷,且大肠杆菌基因改造技术更为成熟,便于对其基因改造。因此,我们以大肠杆菌为出发细胞,利用代谢工程的手段对其进行改造,获得了表达菌株wgc,进行发酵条件优化后获得最高柠檬酸产量为1673 mg/L。主要内容及结论如下:（1）利用PCR技术从大肠杆菌W中克隆柠檬酸合酶基因gltA,并通过克隆在glt A两端引入启动子BBa＿J23100、5’UTR和终止子BBa＿B1001,得到glt A表达盒;将glt A表达盒连接到p UCm-T载体上进行酶切鉴定和测序,证实了glt A表达盒的正确性;通过PCR敲除了pCOLADuet-1载体上的T7启动子和终止子获得基因片段pCOLA,将glt A表达盒与基因片段pCOLA连接,成功构建了表达载体pCOLA-glt A并将其转化大肠杆菌W,获得表达菌株wg。（2）利用PCR技术在化学合成的cad基因（编码顺乌头酸脱羧酶,密码子已优化）两端引入启动子tac、5’UTR和终止子BBa＿B1001,得到cad表达盒;通过PCR敲除了pCDFDuet-1载体上的T7启动子和终止子获得基因片段pCDF,将cad表达盒与基因片段pCDF连接,成功构建了表达载体pCDF-cad并将其转化大肠杆菌wg,获得表达菌株wgc。（3）使用表达菌株wg和wgc进行摇瓶发酵,wg菌株最高柠檬酸产量为149 mg/L,wgc菌株最高柠檬酸产量为244 mg/L,wgc产柠檬酸含量比wg高1.6倍左右,因此,确定重组菌株wgc为生产柠檬酸的优良菌株。使用wgc重组菌种发酵生产柠檬酸,通过单因素试验对碳源、初始糖含量、温度、pH、接种量和外源添加酵母膏等发酵条件进行优化,单因素试验结果表明,在蔗糖8 g/L、温度35℃、p H 7.0、接种量4%和不添加外源酵母膏的条件下获得最高柠檬酸产量为1551 mg/L。在单因素实验的基础上,选择温度、发酵时间、接种量为自变量,以柠檬酸产量为响应值进行响应面试验,确定了最佳发酵条件为发酵温度35℃,发酵时间95 h,接种量4%,在此条件下,测得柠檬酸产量为1673 mg/L。综上所述,本课题在大肠杆菌W中通过代谢工程改造、基因优化和表达元件替换等方法,成功得到了一株生产柠檬酸的大肠杆菌工程菌株,这是首次使用大肠杆菌进行柠檬酸的生产的研究,对利用大肠杆菌生产柠檬酸的探索具有重要的指导意义,为工业化生产柠檬酸提供另外一种有前景的方法。