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猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)能够引起不同年龄和品种的猪发生以呕吐、严重腹泻和脱水为特征的胃肠炎，该病是一种高度传染性病毒性肠道疾病,两周龄以内的仔猪致死率可达100%。黏膜免疫是对本病免疫保护的最佳途径。本研究选用TGEV S蛋白中能够诱导机体产生中和抗体的非糖基化的线性表位D抗原位点作为靶基因片段，通过乳酸菌系统对其进行表达，同时选择胞壁酰二肽和促吞噬素与D位点共表达，分析评价其对特异性免疫应答的影响。本实验首先对胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）和促吞噬素（Tuftsin）二十聚体（20MT）进行密码子优化后，串联形成四十聚体（40MT）。分别将20MT和40MT与6D相连，然后将6D、20MT-6D和40MT-6D分别克隆到pPG612载体中，电转化干酪乳杆菌感受态细胞中，获得阳性重组菌,分别命名为rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds、rLc:pPG612-40MT-6Ds。将重组菌rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds在2%D-木糖MRS培养基中诱导后，进行Western-blot检测，结果表明：目的蛋白获得表达，蛋白大小分别为27kDa、43kDa、59kDa，符合预期大小；取诱导后的培养上清，进行ELISA检测，结果表明，三组重组菌经诱导后，目的蛋白均获得了分泌表达。将6-8周龄BALB/c小鼠随机分成5组，每组12只，口服免疫，分别为鲜奶对照组、rLc:pPG612组、rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds组。口服免疫活菌量为109个/只，连续三天灌服，每隔1周加强免疫一次，共免疫三次。分别于免疫前和免疫后定期采集各组血清、粪便、泪液、鼻黏液、外生殖道黏液。通过间接ELISA检测，进行数据统计分析，结果表明，rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds免疫组特异性IgA和IgG抗体水平均明显高于rLc:pPG612-6Ds，且rLc:pPG612-20MT-6Ds免疫组抗体水平要高于rLc:pPG612-40MT-6Ds免疫组。细胞中和试验结果表明， rLc:pPG612-6Ds， rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds组免疫小鼠所得血清的中和效价分别为1:15、1：32和1:60，肠黏膜抗体IgA中和效价分别为1:32、1:51和1:64。研究结果表明，口服免疫表达6Ds、20MT-6D和40MT-6Ds蛋白的重组乳酸菌均能诱导产生系统免疫和黏膜免疫，经口服免疫后，诱导产生的黏膜免疫反应不仅局限于胃肠道，还可以诱导其他黏膜部位产生特异性免疫反应。将新分离的免疫鼠脾细胞稀释成5×106个/mL，经流式细胞术检测Th细胞亚类Th1、Th2、 Th17和Treg，分析MT在Th细胞水平上对免疫调节的作用途径。实验结果表明，rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6D组的Th1、Th2和Th17相对于rLc:pPG612-6D组和rLc:pPG612组有明显的增高，且差异极显著。rLc:pPG612-20MT-6Ds组的Th亚类细胞都明显高于rLc:pPG612-40MT-6D组，且差异极显著。 rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6D组Th1/Th2细胞均发生明显平衡漂移，分析确定MT为Th1类型佐剂。同时，检测Th17和Treg细胞水平，结果表明：rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds三组的Th17细胞水平相对于rLc:pPG612明显上调，且差异极显著，rLc:pPG612-40MT-6Ds组显著高于rLc:pPG612-20MT-6Ds组。rLc:pPG612-20MT-6Ds组和rLc:pPG612-40MT-6Ds组的Treg细胞水平相对于对照组rLc:pPG612和rLc:pPG612-6Ds组明显降低，且差异极显著。rLc:pPG612-40MT-6Ds组的Treg细胞水平与rLc:pPG612-20MT-6Ds组相比，下降更明显，且差异极显著。以上结果表明：MT为Th1型免疫增强剂，不仅可以增强特异性免疫应答水平，同时也具有调节免疫机制和抗免疫抑制的作用。综上所述，本研究重组的干酪乳杆菌不仅诱导产生了体液免疫和黏膜免疫，同时胞壁酰二肽和促吞噬素（MT）还增强了体液免疫和黏膜免疫应答水平，并作为一种Th1型佐剂产生细胞免疫应答，同时增强Th17细胞活性发挥佐剂功能，并具有抗免疫抑制作用。为进一步研制预防TGEV有效的口服疫苗奠定了基础，并为新型免疫佐剂的研制提供参考。