研究背景和目的：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的严重威胁人类健康的慢性传染病。MTB属细胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞通过TCR识别抗原，识别过程还受细胞表面的MHC分子限制。TCR分别由α/β或γ/δ两条多肽链通过二硫键连接而成的膜结合型异二聚体。其中TCRα/β型大约占95％，在免疫中起主要作用。MTB感染后，T淋巴细胞通过其TCR特异的结合单核-巨噬细胞递呈的抗原，进而介导一系列的免疫反应。 由于TCR的α和β链分别由Vα-Jα-Cα及Vβ-Dβ-Jβ-Cβ基因片断重排后编码，可构成具有不同特异性的TCR分子，由此决定T细胞识别抗原的多样性和特异性，从而可对环境中千变万化的抗原产生特异性应答。目前已知TCRVα分为32个功能性基因家族，TCRVβ分为24个基因家族。TCR重排过程中，V-(D)-J的基因片段进行重排和随机插入核甘酸(N区)形成一高度可变区，称为互补决定区3(CDR3)。通过对CDR3序列的分析，可作为判别T细胞克隆性的指标。 目前，有关不同疾病个体TCRVα、Vβ限制性取用及CDR3谱型的研究范围广泛涉及感染性疾病、自身免疫性疾病、血液病、肿瘤等领域。但是有关结核病人TCR克隆性增殖的研究报道较少。TCR谱型的研究方法主要有：定量PCR、PCRDNA印迹、PCR-单链构象多态性(SSCP)、PCR-序列分析和PCR-Genescαn(基因扫描)-序列分析等多种方法。近年来多采用TCRVα32个家族、TCRVβ24个家族分别设计上游引物，针对TCR保守的C区或选取J区设计下游引物，分别配对扩增TCR序列中包括CDR3区的部分区域。获得PCR产物直接或克隆后测序，通过分析其TCR取用特点和CDR3谱型研究其与疾病的关系。此方法虽然较为灵敏和准确，但是分别配对扩增工作量相对较大。因此有必要建立一种相对较为简化的多重PCR扩增方法。而且，以往的研究多集中于TCRβ链，但是，对于α/βT细胞TCR的功能性研究应包括α和β链。 我们的目的是建立TCRα和β链多重PCR扩增方法，并扩增出结核病人病变局部标本中特异性淋巴细胞TCRα和β链全长序列。扩增的PCR产物进行克隆并测序，测序结果利用DNAstαr软件及网上TCR资源进行分析比对，进而研究结核病人在结核活动期是否存在T细胞克隆性增殖，确定TCRVα、Vβ以及Jα、Jβ所属家族，研究特异性克隆增殖T细胞TCR谱的取用格局，以及TCRα和TCRβ链各自的CDR3谱型，为进一步研究MTB特异反应性TCR四聚体建立基础。 研究内容和方法：分离活动性肺结核病人肺泡灌洗液(BAL)和胸水(PLF)标本中的淋巴细胞，胸水标本分离的淋巴细胞进一步分离CD4+、CD8+细胞，然后分别提取其总RNA。胸水标本分离的部分淋巴细胞染色后进行流式细胞分析。提取的RNA利用AltasSwitchMechanismAtthe5-endofReverseTranscript(SMART)方法逆转录并进行LDPCR合成cDNA第二链。根据现有文献设计能扩增包括TCRα和TCRβ链先导序列起始密码的各自特异上游扩增引物，及根据TCRC区保守序列设计的下游引物(包括终止密码)，进行多重PCR扩增，以分别获得TCRα和TCRβ全长编码序列。获得的PCR产物回收后用限制性内切酶进行酶切，与相应的酶切处理的载体纯化产物进行连接反应。连接产物转化感受态细菌JM109，挑取氨苄青霉素抗性单菌落经培养后小量提取质粒，然后用相应的内切酶进行酶切鉴定。阳性克隆委托公司测序。测序结果用DNAstar软件及网上TCR资源进行分析、比对，确定扩增序列TCRVα、TCRVβ所属亚家族，研究T细胞的克隆增殖情况、TCR谱取用格局及各TCRα和TCRβ链的CDR3碱基和氨基酸序列。 结果：活动性肺结核肺泡灌洗液标本3例，磁珠分离纯化结核胸水标本CD4+、CD8+淋巴细胞2例并分别扩增出TCRα和TCRβ链PCR产物。α链长800bp左右，β链长900bp左右。PCR扩增产物经克隆测序共获得65个α链全长序列，38个β链全长序列。 序列结果分析：TCRα链以AV1S2、AV12S3、AV12S2、AV12S1为主，主要集中于AV1S2(50.8％)、AV12S3(46％)；TCRβ链以BV2、BV29S1、BV14、BV4S1、BV4S2为主，主要集中于BV2(36.8％)、BV29S1(52.6％)。 氨基酸序列分析显示同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性，但是在BAL及PLF标本中，各病例内或病例之间也发现有个别相同或相似的氨基酸序列：BAL标本1、BAL标本3与PLF标本1、PLF标本2的CD8+各有一条β链的CDR3区具有相同的氨基酸序列：SVGTGTLHQETQY；BAL标本2和BAL标本3的各有2条α链有相同的CDR3序列：AVRDWAGNMLT；PLF标本2的CD4+、CD8+淋巴细胞各有2条α链有相同的CDR3序列：AVRDQNYQLI。在某些不同的克隆也存在不同长度的相同基序。在BAL标本2的一个α链和一个β链的CDR3均有：AV…DNN…RLW序列；在PLF标本1的CD8+淋巴细胞的两条α链CDR3均含有：AMSDGN…NMLT；在PLF标本2的CD8+淋巴细胞的两条α链CDR3均含有：AM…DDKII。 8例活动性肺结核病人PLF标本流式分析结果：CD4+、CD8+T淋巴细胞分别约占PLF总细胞的40％～60％和20％～30％。 结论：建立多重PCR方法扩增活动性结核患者病变局部标本TCRα和β链全长序列，既减少以往针对TCRVα、TCRVβ各亚家族分别进行扩增的工作量，又能满足临床小量样本的要求。 序列分析提示结核患者病变局部存在特异性T细胞的克隆性增殖，TCRα和β链谱型呈限制性取用。克隆增殖的TCRCDR3氨基酸序列呈多样性特点，但是在同一患者及不同患者也存在个别相同的CDR3氨基酸序列，提示这些相同的CDR3氨基酸序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。 流式细胞及TCR序列分析结果显示，在结核患者病变局部存在结核特异性T淋巴细胞的集聚。集聚的T细胞以CD4+T细胞为主(40％～60％)，CD8+T细胞次之(20％～30％)，提示这2类T细胞均参与结核(患者病变局部)的特异性免疫，其中CD4+T细胞可能起中心角色。 获得的MTB特异反应性TCR克隆为进一步研究MTB特异反应性TCR四聚体建立了基础。