研究背景和目的： 肠出血型大肠埃希菌(EnterohaemorrhagicE.coli，EHEC)O157：H7是一种新现肠道致病菌，能引起人出血性肠炎(Hemorrhagiccolitis，HC)、溶血性尿毒综合征(Hemolyticuremicsyndrome，HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(Thromboticthromobocytopenieporpura，TTP)等。 1982年在美国密执安州和俄勒冈州，Riley等报道了因食汉堡包引起的食物中毒事件，最后确认病原菌是EHECO157：H7。随后世界各地均有发生EHECO157：H7流行。美国于1993年发生了一次涉及到4个州700余名儿童的EHECO157：H7暴发，其中51例发生了HUS，4例死亡。1996年5—8月在日本发生了一起涉及30多个县市的的EHECO157：H7暴发流行，患者9000余名，死亡9人。1999-2000年我国苏皖等地发生的EHECO157：H7大规模暴发流行，患者约2万人，发生急性肾功能衰竭者195人，死亡人数177人，可能是迄今为止世界上流行规模最大、死亡人数最多、流行时间最长、发病原因最复杂的一次。EHECO157：H7的感染呈暴发流行趋势，具有强烈的致病性与致死性，已成为全球性的公共卫生问题。 EHECO157：H7致病性相关的毒力因子有紧密黏附素(Intimin)、志贺毒素1型、2型(Shigatoxin，Stx1、Stx2)和溶血素(Haemolysin，Hly)等。EHECO157：H7的致病作用主要通过细菌对肠黏膜上皮细胞粘附和产生毒素两个过程。EHECO157：H7侵入机体后，通过菌毛局限性地粘附在盲肠和结肠上皮细胞的刷状缘上并损害微绒毛，此后细菌染色体LEE(Locusofenterocyteeffacement)毒力岛上的eae基因编码的Intimin介导细菌紧密粘附在肠上皮细胞膜上，导致在肠上皮细胞与细菌接触处的邻近部位肌动蛋白和肌球蛋白等积聚，形成垫状结构，这种损害被称为粘附—抹去(Attachingandeffacinglesion，A/Elesion)损伤。在EHECO157：H7特征性A/E损伤的发生过程中，Intimin起非常重要的作用，有研究表明Intimin是EHECO157：H7在人肠道粘膜定居并引起A/E损伤所必需。Tzipoai等使染色体上eae基因突变致EHECO157：H7不能粘附到上皮细胞，当eae基因用质粒载入后，细菌的粘附能力随即得到恢复，从而进一步证实了Intimin与致病能力的关系。 目前，在EHECO157：H7的快速检测、致病机制、药物研制等仍存在许多问题，因此研究EHECO157：H7的疫苗成为防治其感染的重要内容。有研究已证实：IntiminC末端280至300个氨基酸残基(IntC280-300)具有很强的免疫保护性。其特异性抗体可以阻断细菌的黏附进而使其丧失致病力，是理想的疫苗备选抗原。国内外已有研究选择IntC300作为疫苗的备选抗原，易勇等利用基因重组技术构建了Stx2B—IntC300融合蛋白疫苗，以致死剂量的EHECO157：H7超声破菌液对免疫小鼠进行攻毒试验，融合蛋白的免疫保护作用为65％，与EHECO157：H7全菌灭活抗原的保护水平相当。Judge等将编码EHECO157：H7IntiminC末端的基因重组入马铃薯染色体中，构建了转基因马铃薯细胞且能成功表达Intimin蛋白。据此研制了口服植物疫苗，对小鼠免疫并攻毒EHECO157：H7活菌后发现能缩短小鼠感染期且减少排菌量。 在上述疫苗研制过程中仍存在一些困难：制备亚单位疫苗，需要表达融合蛋白，抗原制备繁琐；而转基因植物疫苗则存在疫苗在人胃肠道易被分解的问题。合成肽疫苗(Syntheticpeptidevaccine)是用化学合成抗原表位氨基酸序列法制备而成的具有保护性作用的类似天然抗原决定簇的多肽疫苗，合成肽疫苗具有安全、廉价、特异性强、易于保存和应用等特点。合成肽疫苗的研究最早始于口蹄疫病毒(FMDV)的合成肽疫苗，Bittll等按照O型口蹄疫病毒VP1的氨基酸序列合成了7种多肽，将这些多肽和钥孔槭血蓝蛋白(Keyholelimpethemocyanin，KLH)偶联，然后与弗氏完全佐剂乳化，制备成合成肽疫苗，能够产生足够的抗体，保护牛和猪不发病。 本研究选择对EHECO157：H7IntC300B细胞抗原表位进行预测，选择一条抗原表位多肽进行合成，然后免疫动物，检测其免疫保护作用，为筛选其抗原表位及进一步研究多肽疫苗提供理论依据。 研究方法： 1.EHECO157：H7IntC300B细胞抗原表位的预测根据从GenBank上查到的EHECO157：H7标准株EDL933Intimin的氨基酸序列(Acessionnumber：CAA77642)，选其C末端300个氨基酸(635—934)为目的片断；采用DNASTAR软件分析IntC300的亲水性、β-转角、柔韧性、表面可及性和抗原指数；利用网络服务器(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.p1)预测IntC300的B细胞抗原趋势；综合各种参数分析的结果，预测出一组EHECO157：H7IntC300B细胞抗原表位多肽。 2.IntC300B细胞抗原表位的抗体效价测定合成一条EHECO157：H7IntC300B细胞抗原表位多肽，序列为：KASITEIKADKT。将抗原多肽与KLH偶联。将6～8周龄的SPF级BALB/c小鼠60只，随机分为4组：皮下免疫组，皮下免疫对照组，鼻腔免疫组，鼻腔免疫对照组，每组15只。将偶联产物与弗氏完全佐剂或霍乱毒素B亚单位(CholeratoxinBsubunit，CTB)混合后通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠，对照组用PBS免疫，每间隔2周加强免疫一次，2、3次免疫后7d每组随机抽10只小鼠从眼眶采集血清，间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价。 3.动物攻毒实验末次免疫10d后以EHECO157：H7活菌进行动物攻毒实验，小鼠于攻毒前禁食、禁水12h，每只小鼠经食道灌注1×1010CFU/mlEHECO157：H7活菌0.3ml。攻毒后12h恢复饮食饮水，并记录动物死亡情况。 结论： 本研究采用DNASTAR软件和网络服务器分析EHECO157：H7IntC300的β-—转角、亲水性、可及性、柔韧性、抗原指数、抗原趋势等参数，结果显示多肽23-34(KASITEIKADKT)、76—88(QTQATTGNDGRAT)、189-198(KATSGDKQTV)、262-279(KQTSSEQRSGVSSTYNLI)和284-296(LPGVNVNTPNVYA)有可能是EHECO157：H7IntC300的B细胞抗原表位。 本文预测的EHECO157：H7IntC300的23-34肽段序列KASITEIKADKT与ADU—BOBIE等经重叠肽验证的肠致病型大肠埃希菌(EPEC)O127：H6IntC280的1-20肽段序列ITEIKADKTrAVANGQDAIT相比，有9个氨基酸残基(ITEIKADKT)是完全相同的。由于编码Intimin的eae基因在EHEC与EPEC之间有约87％的同源性，它们之间很可能也有相同的抗原位点，所以这个肽段作为EHECO157：H7的抗原位点的可能性也很高。 选择合成多肽23-34，通过皮下和鼻腔两种途径免疫小鼠，发现其可在小鼠体内产生特异性IgG和IgA抗体，皮下免疫组的血清IgG抗体滴度达到6400，鼻腔免疫组为1600。鼻腔免疫组获得的IgA抗体滴度(3200)明显高于皮下免疫组(100)。对小鼠进行致死量EHECO157：H7活菌攻毒后，皮下免疫组产生的免疫保护性与其对照组没有统计学意义，鼻腔免疫组能对EHECO157：H7活菌攻毒产生一定的免疫保护作用。 本研究表明EHECO157：H7IntC300的23-34(KASITEIKADKT)多肽与载体蛋白偶联后，通过鼻腔免疫小鼠可以引起小鼠产生保护性免疫应答，提示IntC300的23-34(KASITEIKADKT)多肽是具有应用前景的EHECO157：H7多肽疫苗的候选抗原。