衰老（Senescence）是指在细胞、组织水平的生理机能的进行性丢失，是众多不同的生理刺激激发细胞出现的一种最终的共同状态。大量实验证明信号通路与衰老的起始和持续密切相关。本实验以用于研究体外复制衰老的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38细胞为模型，探讨细胞复制衰老过程中JAK／STAT信号通路的主要成员Stat3活性的变化、MMPs／TIMPs系统的变化、AngⅡ的作用及AngⅡ调控下游基因表达的有关信号通路，揭示衰老发生的机制。 第一部分实验采用Western blotting、间接免疫荧光和EMSA等方法。结果显示：AngⅡ通过其AT1受体诱导WI-38细胞Stat3、Stat1的磷酸化，形成以磷酸化的Stat3同源二聚体SIF-A为主的复合物转位入核；AngⅡ以量效、时效的方式诱导SIF-DNA的结合，10-7M或10-6M的AngⅡ刺激细胞60min能够最大强度的诱导SIF-DNA的结合，说明AngⅡ能够活化WI-38细胞中JAK／STAT信号通路。 第二部分实验结果显示，细胞在复制衰老过程中，Stat3的活性组成型或生长因子刺激后都有改变。应用Northern blotting检测了年轻细胞和衰老细胞中Stat3 mRNA的表达，结果发现衰老细胞中Stat3 mRNA的表达与年轻细胞比无明显的差别，而Western blotting示衰老细胞中Stat3蛋白的 第四军医大学博士研究生论文表达明显高于年轻细胞，其活性形式磷酸化的Stat3中Stat3)的表达也不低于年轻细胞；Aug 11刺激细胞后，无论年轻细胞还是衰老细胞，Aug 11都能以同样强度诱导胞浆中Stat3的磷酸化，但在衰老细胞核中，无论是组成型的或Aug 11刺激后的，pstat3蛋白水平都明显低于年轻细胞，提示衰老细胞中pstat3转位入核受阻；在衰老细胞中，Aug 11同样以量效、时效的方式，通过其AT；受体诱导Sff－DNA结合，10”’M的Aug 11刺激衰老细胞45－60min能够最大强度的诱导Sff－DNA的结合。由前两部分实验结果可推测出细胞复制衰老过程中，信号转导分子与基因组DNA结合活性所发生的变化，可能影响下游基因的表达。 第三部分实验的明胶酶谱结果显示：WI－3 8细胞主要分泌 MMP－2，且年轻细胞中的MMP－2活性明显强于衰老细胞，年轻细胞和衰老细胞中＊＊P9的活性均较弱，两者之间无明显差别：An gll刺激细胞48h时，年轻细胞和衰老细胞中MMP－二的活性稍有增加，两者之间无差别，而Aug 11对 MMP一的活性无明显影响。衰老细胞中组成型的 TIMP上的表达明显高于年轻细胞，且 Aug 11可明显上调衰老细胞 TIMPq的表达，在Aug 11刺檄衰老细胞 6h时，TWl蛋白的表达己开始上调，12h达峰值，48h时降至基础水平。考虑到TIMP刁启动子区含有S丁结合位点，Aug11有可能通过STAT通路调控TM－l的表达，为此进行了细胞转染实验，结果显示转染Stat3反义质粒、Stat3显性负调突变体质粒及Stat3反义寡核苦酸的衰老细胞，用 Aug 11刺激后，上调的 TIMP＊的表达明显受抑，说明 Aug 11通过 STAT通路上调衰老细胞 TIMP刁的表达。由此可以想象在衰老细胞中TIMP－l等的组成型表达或生长因子诱导表达增加，可通过抑制MMP－9的活性来促进维持正常状态，形成衰老特异的生理、形态的变化。在细胞衰老过程中，M：MPs／TIMPS比率的下降，通过抑制永生细胞的出现，在避兔肿瘤的形成中起着主要的作用。推测下调TIMP－l等表 4达的细胞因子或生长因子可能与肿瘤的发生有关。相反，上调TIMP－1表达的可能与衰老或硬化有关。 总之，细胞复制衰老过程中Stat3活性下降，不是衰老细胞Stat3磷酸化的减少，而是活化的 Stat3核转位受阻；Aug 11可以诱导衰老细胞Stat3．DNA的结合；WI－3 8细胞主要分泌 MMP－2，其活性在衰老细胞中明显低于年轻细胞；衰老细胞TIMPl 蛋白的表达明显高于年轻细胞，Aug 11能够上调衰老细胞 TIMPl的表达，这一作用依赖于 Stat3的活化。从本实验可以看出，STAT信号通路介导了衰老信号，参与调控下游基因的表达。本研究初步揭示了衰老细胞形态、生理功能发生改变的分子机制，Aug 11参与衰老的机理，提示通过应用 ACEI或 ATI RA阻断 RAS系统，直接或间接干预 Aug 11的信号通路，可阻滞 Aug 11上调 T侧l的表达，有可能成为延缓衰老、组织硬化进程的有效方法。