长春花含有多种单萜类吲哚生物碱（monoterpenoid indole alkaloids,MIAs）,既是研究MIA生物合成途径的模式植物,也是抗癌药物长春碱和长春新碱的唯一植物来源。研究长春花中MIA的生物合成、调控和运输具有重要的理论和应用价值,可为MIA类药物的生产和研发奠定基础。单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）是一项在单细胞水平研究基因时空表达谱的新兴技术,在植物的生长发育和环境刺激应答等研究领域具有巨大的应用潜力。植物单细胞的获取与动物不同,需要通过制备原生质体来实现。由于原生质体制备的技术难度较高,导致scRNA-seq技术在植物中的应用受到极大的限制,植物scRNA-seq研究主要集中在拟南芥、水稻和玉米等模式植物和重要农作物中,目前还没有应用于药用植物中的公开报道。本论文首先通过研究叶龄、酶组合、酶解时间、离心转速和离心次数等因素对原生质体质量和产量的影响,建立适用于scRNA-seq 的长春花叶片原生质体分离体系。以茎尖顶端第一对完全展开的叶片为材料,最适的酶液组合为1.0%（v/w）纤维素酶R-10+0.15%（v/w）离析酶R-10,最适的酶解时间为2h,以100×g的离心速度离心两次后的纯化效果最佳。收集0.5g的叶片组织,进行酶解,分别采用血球计数板计数法和台盼蓝染色法计算原生质体数量和活细胞比例。取大约25 000个活细胞与10x Genomics单细胞反应试剂,构建scRNA-seq文库,用Illumina平台测序。利用Cell Ranger对测序数据进行分析获得基因表达矩阵,共得到10 695个细胞和18 987个表达基因。然后使用Seurat2软件包对数据进行质控和过滤,去除双细胞、多细胞或死细胞等低质量数据后,共获得8741个高质量细胞,平均每个细胞的UMI（Unique Molecular Identifier）数为3435,表达的基因数目为1393个。降维聚类分析后,得到11个cluster,并使用一系列已知的标记基因鉴定了表皮细胞、叶肉细胞、韧皮部薄壁细胞、维管束细胞和异形细胞等多种细胞类型,并发现了多个具有细胞类型特异性的新标记基因。KEGG富集结果显示细胞类群的注释结果与其生物学功能相匹配,叶肉细胞的差异表达基因参与光合作用的碳固定、天线蛋白合成等,异形细胞的差异表达基因集中在单萜吲哚生物碱的合成、次生代谢物的合成、植物和病原体的互作等过程。本论文分析了长春花生物碱合成途径中全部基因在不同细胞类群中的表达模式,揭示了生物碱合成途径在叶片中的空间分布。合成长春碱的前15步酶促反应主要发生在韧皮部内薄壁细胞,包括整个MEP（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate）途径和环烯醚萜途径的前7步酶促反应。有13个长春碱生物合成途径中的基因在MIA合成相关细胞（MIA associatedcell,MIAC）中表达,包括3个催化合成异胡豆苷的基因,2个吲哚途径基因以及8个合成多种MIAs的下游合成途径基因。在MIAC中合成的dihydroprecondylocarpineor是长春质碱和水甘草碱的共同前体物质,它被转运至表皮细胞后,可以被催化生成长春质碱和水甘草碱。从水甘草碱到文多灵的合成途径中前四步酶促反应也是在表皮细胞中进行的,后三步催化合成文多灵的酶促反应在异型细胞进行。最后,长春质碱和文多灵在表皮细胞中缩合生成双吲哚生物碱长春碱和长春新碱。本研究利用scRNA-seq测序技术获得了长春花叶片的单细胞基因表达图谱,通过降维和聚类分析对叶片细胞进行了分群和鉴定,首次在单细胞水平阐述了长春花叶片中吲哚生物碱合成途径基因的时空表达特征。该研究为次生代谢产物生物合成途径的空间分布研究开辟了新途径,将推动scRNA-seq技术在药用植物研究领域中的进一步应用。