蛋白酶是一种重要的工业酶制剂,也是生命科学研究中的重要主题内容,其多样性研究对揭示生命活动的过程与本质具有重要意义。蛋白酶对特定蛋白质的降解,能够制备具有生理活性功能的肽类化合物,也可用于制备蛋白类生物材料。而对特定蛋白质肽键的专一、有效降解是获取活性肽或生物材料的技术关键,需要筛选特异性的蛋白酶。目前优质蛋白酶基因资源有限,且已报道蛋白酶表达水平普遍偏低,在一定程度上影响了蛋白酶产业化的研究与应用。本文以来自于弧菌Vibrio sp.DA1-1的碱性蛋白酶基因AprV为目标,开展重组表达、分离纯化和酶学性质研究等工作,并初步考察其对海参蛋白质的水解和活性多肽制备。主要研究结果如下:（1）从实验室前期筛选获得的弧菌Vibrio.sp.DA1-1基因组中扩增获得大小约为1200 bp的碱性蛋白酶基因aprV,并成功构建pET28a-aprV重组质粒,转入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）p LysS,构建了碱性蛋白酶AprV重组表达菌株Escherichia coli BL21（DE3）pLysS（pET28a-aprV）,经诱导表达,AprV酶活为45.81 U/mL。利用NCBI数据库中已报道的同源序列构建AprV系统发育树并进行序列比对分析,发现与来自于Alkalimonas collagenimarina的枯草杆菌丝氨酸蛋白酶相似性最高,为68%。AprV蛋白酶属于肽酶S8家族,催化活性位点为Asp（169）、His（202）和Ser（358）。以PDB数据库中高同源性蛋白质晶体结构为模板,对AprV进行同源建模分析,结果显示该酶由11个ɑ-螺旋、9个β-折叠以及若干无规则卷曲构成,通过分析同源模型。（2）对Escherichia coli BL21（DE3）pLys S（pET28a-aprV）重组菌蛋白诱导条件进行了系统优化,使酶活提高了1.98倍,总酶活达到90.58 U/m L。通过设计引物在AprV蛋白酶上成功添加6×His标签,利用该标签及蛋白分子量的差异,通过Ni-NTA以及Superdex 75 10/300 GL柱对碱性蛋白酶AprV进行纯化,获得大小为28 kDa的电泳纯重组蛋白酶AprV,回收率为8.98%,纯化倍数为25.09。经测定,AprV纯蛋白比活为1139U/mg。通过分析发现AprV蛋白含有N端前肽和一个C端催化结构域,在形成成熟蛋白过程中N端前肽会自动脱落。（3）对纯化后的重组蛋白酶AprV进行酶学性质探究。结果发现,AprV最适反应温度为55°C,最适反应pH为10.0。在pH 7.0-12.0的范围内稳定性较好,在40°C放置40 min,残余活性仍保持在70%以上。AprV可被20 mM EDTA完全抑制,证明AprV属于金属蛋白酶类。蛋白酶AprV对吐温20-80,JFC-2和H₂O₂,DTT耐受性较好,但SDS对AprV具有明显抑制作用。2 mM K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Co²⁺对AprV有轻微的激活作用,而2 mM Cu²⁺和Mn²⁺对AprV激活作用较为明显。5 mM Sn²⁺对AprV有很强的抑制作用,抑制率为67.4%。为进一步提升该酶的应用潜力,本实验通过定向进化技术手段对重组酶进行定点改造,成功获得突变体M5,其酶活提高了1.3倍。（4）利用获得的重组蛋白酶AprV降解海参蛋白,制备具有生物活性的海参多肽。相比于酸性蛋白酶,AprV酶解海参样品效果较好,成品中蛋白含量约为130μg/mL,SDS-PAGE分析可检测到明显的小分子量蛋白及多肽片段水解度为16.7%。制备获得的海参多肽分子量分布在100-1500 Da之间。另外,AprV蛋白酶可以用于胶原蛋白多肽的制备,本论文中成功获得分子量在100-1500 Da之间的胶原蛋白肽。