猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染引起的猪的一种慢性呼吸道疾病,具有流行广泛、发病率高、死亡率低的特点。本课题组通过长期研究发现,猪肺炎支原体感染主要刺激机体产生体液免疫,但机体抗感染能力有限,加之未有彻底清除或杀灭猪肺炎支原体的抗生素和疫苗,致使猪肺炎支原体持续潜伏感染。因此,我们推测猪肺炎支原体作为一种传统认为的胞外菌也能存在于宿主细胞。自噬是一种依赖溶酶体的降解过程,在维持细胞内环境稳定的过程中起着重要作用。自噬一方面能够清除进入细胞内的病原,另一方面一些病原微生物能够利用自噬在细胞内寄居逃避免疫细胞的杀灭。因此我们推测猪肺炎支原体可能利用自噬实现了在宿主细胞内的存活甚至增殖。为了探究猪肺炎支原体感染宿主细胞后诱导的自噬反应及其增殖与自噬的关系,本课题从以下几个方面展开研究:1.Mhp能够存在于细胞内的验证目的:确定Mhp能够存在于细胞内。方法:首先检测猪肺组织细胞内是否存在Mhp。采集30份具有MPS典型病变的肺组织和30份健康肺组织进行套式PCR检测Mhp,将Mhp阳性的病变肺组织和Mhp阴性的肺组织细胞进行细胞培养,间接免疫荧光检测细胞中Mhp。其次确定Mhp能否感染进入猪源细胞系。以经典的用于研究Mhp与细胞相互作用的猪肾细胞系PK15作为本研究的细胞系。确定Mhp AH株的生长曲线和感染PK15细胞的最佳感染复数后,AH株以最佳感染复数感染PK15细胞,确定AH株能否进入PK15细胞。结果:共有28份有MPS典型病变的肺组织检测到Mhp,9份能够成功培养且在细胞内检测到Mhp。AH株感染PK15细胞的最佳感染复数为500。免疫荧光试验显示AH株进入PK15细胞。结论:Mhp感染宿主细胞后能够进入宿主细胞内。2.Mhp感染诱导自噬反应的研究目的:确定Mhp能够诱导自噬发生。方法:首先用间接免疫荧光检测有猪支原体肺炎典型病变的肺组织细胞内和正常无Mhp感染肺组织细胞内LC3斑点数量的差异。接着用透射电镜检测了Mhp感染PK15细胞后细胞内自噬体的存在情况。Western blot检测了Mhp感染PK15细胞后自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin 1的表达情况,并用间接免疫荧光检测了PK15细胞内Mhp和LC3蛋白的共定位情况。结果:病变的肺组织细胞内LC3的斑点量显著高于健康肺组织细胞内LC3的斑点量。透射电镜检测显示,与未感染组,Mhp感染的PK15细胞中自噬体数量明显增加。LC3-Ⅱ在Mhp感染2 h后,随着感染时间的延长,与对照组相比表达量显著增高;Atg5和Beclin 1在Mhp感染30 min后,随着感染时间的延长,与对照组相比表达量显著增高。PK15细胞中Mhp和LC3蛋白形成共定位,且与未感染Mhp组相比,感染Mhp的PK15细胞中LC3斑点数明显增多。结论:Mhp感染能够诱导猪肺组织细胞和PK15细胞发生自噬反应。3.Mhp感染诱导不完整自噬流的研究目的:确定Mhp感染能否形成完整自噬流及影响自噬流的关键信号分子。方法:Mhp AH株感染PK15细胞,Western blot检测自噬流标志蛋白p62的表达情况,以及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)处理后p62和LC3-Ⅱ的表达情况。结果:在Mhp AH株感染PK15细胞后4 h、8 h、12 h时,p62的表达显著高于对照组,且随感染时间延长而升高,说明Mhp感染PK15细胞后未形成完整自噬流。用自噬抑制剂3-MA处理后,细胞中p62和LC3-Ⅱ的蛋白水平在感染4 h、8 h、12 h时显著降低,说明自噬诱导被抑制后,自噬流也被抑制,从而抑制了p62的表达。结论:Mhp感染后诱导不完整自噬流。结论:Mhp感染后诱导不完整自噬流。4.自噬促进PK15细胞内Mhp增殖的研究目的:确定自噬对Mhp在细胞内增殖的影响。方法:MhpAH株感染PK15细胞,Western blot检测PK15细胞内Mhp的结构蛋白P97的表达,测定Mhp感染PK15细胞内Mhp的颜色变化单位(Color changing unit,CCU)以及抑制剂3-MA处理细胞内Mhp的CCU。结果:MhpAH株感染PK15细胞4 h后,3-MA处理组细胞内P97的表达量显著低于未处理组。在感染4 h、8 h、12 h时,3-MA处理组细胞内Mhp的含量显著低于未处理组。结论:自噬促进细胞内Mhp的增殖。综上所述,Mhp感染细胞后能够进入细胞内,诱导自噬的发生,但自噬体不能与溶酶体融合形成自噬溶酶体降解Mhp,从而使Mhp在细胞内实现增殖。