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目的:探讨邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)在不同染毒浓度下,对小鼠睾丸间质细胞(TM-3)活性的毒作用,以及激活内质网应激反应并通过葡糖糖调节蛋白78(GRP78)-活化转录因子4(ATF4)-C/EBP同源蛋白(CHOP)通路致细胞凋亡的过程,进而探讨TM-3细胞凋亡过程中MBP和MEHP联合染毒对细胞凋亡的影响。方法:1,用10%的胎牛血清及双抗(青霉素和链霉素)和DMEM高糖的完全培养基体外培养TM-3细胞,每隔12小时测量细胞密度并绘制出细胞生长曲线;2,将小鼠睾丸间质细胞以初浓度0(对照组)、50、100、200、400、800μmol/L不同浓度梯度的MBP、MEHP和MBP+MEHP,分别作用小鼠睾丸间质细胞24、36、48小时;3,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测染毒组对细胞活性的影响,按照抑制率计算公式计算出染毒对细胞活性抑制率的影响,参考改良寇氏法计算出的半数抑制剂量来确定后续染毒剂量和染毒时间,观察染毒后细胞状态形态变化;4,在透射电镜下观察细胞内质网的超微结构变化;5,用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞早期凋亡和总的凋亡情况;6,采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞裂解液中的葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子4(ATF4)和DDIT3/GADD153蛋白(CHOP)含量的变化。结果:1,在正常状态下培养TM-3细胞,每12小时测一次细胞密度,通过细胞生长曲线可以看出:在0-12小时内,细胞数量并没有大量增加,在12-24h时间段内,细胞贴壁且状态变好边界清晰胞质透明,数量开始增长,在24至60h时间段内,处于对数生长期且细胞正常状态下的凋亡数量比较稳定,60-108h时间段细胞总数量在增长,但凋亡的细胞数量也在增长;2,与对照组相比较,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒组均可致TM-3细胞活性下降,差异具有统计学意义(P<0.05),在染毒24h和在200、400和800μmol/L的剂量下对细胞抑制率较为稳定,在染毒24h且400μmol/L的染毒条件下经2×2析因设计方差分析,MBP+MEHP联合染毒组对TM-3细胞的抑制率具有交互作用,作用类型为拮抗作用;3,透射电镜下可见与对照组比较,MBP、MEHP和MBP+MEHP联合染毒在400μmol/L染毒24h可以引起细胞内质网结构的损伤,主要表现为内质网肿胀,数量减少,核糖体脱落,后期成为空泡样结构;4,与对照组(0)相比,在24h且200、400、800μmol/L的MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒情况下均可致TM-3细胞早期凋亡和总的凋亡数量均增加且具有统计学意义(P<0.05),在24h,400μmol/L的染毒条件下,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒经2×2析因设计方差分析具有交互作用,且交互方式为拮抗作用(P<0.05);5,与对照组相比,在24h且200、400和800μmol/L的染毒条件下MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒组GRP78蛋白、ATF4蛋白和CHOP蛋白表达量增加,变化具有统计学意义(P<0.05),在24h,400μmol/L的染毒条件下MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒组GRP78蛋白、ATF4蛋白和CHOP蛋白的均比对照组表达量增高且具变化有统计学意义(P<0.05),经2×2析因设计方差分析具有交互作用,且为拮抗作用,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1,体外培养的TM-3细胞在培养24h细胞状态良好,24-60h内细胞处于对数增长期,可进行实验操作;2,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒组均对细胞活性有抑制作用,且在400μmol/L,染毒24h的条件下存在交互作用,类型为拮抗作用;3,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒可损害细胞内内质网结构;4,MBP、MEHP和M BP+MEHP染毒组均可致细胞凋亡,且随着剂量的增加细胞的凋亡数量也在增加,变化具有统计学意义,在400μmol/L,染毒24h的条件下也存在交互作用,作用类型为拮抗作用;5,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒均可致TM-3细胞裂解液中的GRP78蛋白、ATF4蛋白和CHOP蛋白表达量增加,并且在400μmol/L,染毒24h的条件下GRP78蛋白、ATF4蛋白和CHOP蛋白的表达量变化具有交互作用,类型也是拮抗作用;6,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒可能是通过内质网应激反应激活GRP78-A TF4-CHOP通路,从而引起TM-3细胞的凋亡。