目的:探讨活血定眩胶囊含药血清对缺氧致小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3损伤和基因表达谱的影响;完善活血定眩胶囊治疗椎动脉型颈椎病的作用机理,为活血定眩胶囊的进一步临床推广应用奠定基础。方法:将bEnd.3分为空白血清正常组,缺氧模型组,尼莫地平对照组,活血定眩胶囊低、中、高剂量含药血清组(按浓度分为5%、10%、15%),给药后,bEnd.3缺氧6 h。在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架变化;应用MTT比色法检测细胞活性;采用黄嗓吟氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用硫代巴比妥酸反应物法测定丙二醛(MDA)含量,采用硝酸根还原酶法检测一氧化氮(NO);使用酶联免疫检测bEnd.3细胞上清液中的VEGF浓度;采用流式细胞术检测bEnd.3细胞周期及早期凋亡率;釆用基因测序技术-数字基因表达谱法观察了活血定眩胶囊含药血清对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3基因表达谱的影响,筛选处理后差异表达的基因,对其差异基因表达模式进行聚类分析、功能显著性富集分析和显著性富集分析,筛选了活血定眩胶囊含药血清干预细胞的过程中差异表达的基因及它们参与的生物过程和最主要的信号转导途径。结果:1.正常组细胞骨架微丝分布规则,彼此连接,附着在细胞内特定部位,呈丝网状有序排列;模型组可见细胞外形皱缩,间隙加大,微丝断裂,排列紊乱,微丝收缩变短或移向周边,丝网状有序排列消失,少部分微丝缺失出现空隙;活血定眩胶囊血清组和对照组可见细胞间隙小,微丝连接,排列紧密,形态成长梭形。说明活血定眩胶囊含药血清能减轻在缺氧条件下bEnd.3的细胞骨架微丝紊乱。2.与正常组比较,模型组在3个时间点OD值均呈现下降趋势,与模型组相比,3个给药组及对照组的OD值呈现不同程度的升高。可以看出,在24h、48h、72h,中剂量活血定眩胶囊含药血清和对照组的作用优于低、高剂量活血定眩胶囊含药血清(P<0.01),中剂量活血定眩胶囊含药血清与尼莫地平组作用无明显差异,表明活血定眩胶囊血清能促进在缺氧条件下bEnd.3的增殖。3.与正常组相比,模型组bEnd.3细胞由于缺氧促进MDA的释放,减少细胞内NO分泌和SOD活性,表明细胞膜受到了明显损伤,通透性增加。与模型组相比,活血定眩胶囊含药血清组和尼莫地平组能显著抑制细胞上清液中MDA的增加,并显著增强NO的量和SOD活性;中剂量活血定眩胶囊含药血清组与尼莫地平组作用无明显差异,中剂量活血定眩胶囊含药血清组明显优于低、高活血定眩胶囊血清组。4.与正常组相比,模型组bEnd.3细胞分泌的VEGF水平呈现增加。与模型组相比,中剂量活血定眩胶囊含药血清组和对照组均促使缺氧bEnd.3细胞分泌VEGF;中剂量活血定眩胶囊含药血清组的改善作用均明显优于低、高剂量活血定眩胶囊血清组。5.与正常组比较,模型组G1期bEnd.3显著增加(P<0.05),S期细胞显著减少(P<0.05),表明缺氧可诱导bEnd.3细胞发生G1/S期阻滞。与模型组相比,活中剂量活血定眩胶囊含药血清组和尼莫地平组显著增加S期细胞(P<0.05),减少G1期细胞(P<0.05);低、高剂量活血定眩胶囊血清组也有效果(P<0.05),表明活血定眩胶囊含药血清能有效抑制缺氧诱导的bEnd.3发生G1/S期阻滞。6.正常组早期凋亡bEnd.3仅有6.5%;缺氧模型组则高达45.5%;低、中、高剂量活血定眩胶囊含药血清组以及尼莫地平组作用于bEnd.3 6h后,早期凋亡细胞分别为28.0%、17.5%、22.7%、16.1%,与模型组相比差异显著(P<0.01);而中剂量活血定眩胶囊含药血清组同低、高剂量活血定眩胶囊血清组比较能够明显抑制缺氧诱导的bEnd.3早期凋亡的进程。7.根据P<0.05,|Fold Change|>3筛选差异基因,空白组与模型组之间共有405个差异基因,其中表达上调的有176个,表达下调的有229个。活血定眩胶囊组与模型组之间共有368个差异基因,其中表达上调的有146个,表达下调的有222个。这些共同的差异基因生物功能包括内皮细胞迁移的正调控、含氧酸代谢过程、血管内皮生长因子的产生、NF-κB转录因子活性的正向调节等,参与的信号通路包括氧化应激诱导的衰老、有丝分裂前期、血小板聚集、血管内皮生长因子信号通路、白细胞介素信号通路、p53通路、TNF-α信号通路、PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路、凋亡信号通路等信号通路。结论:1.活血定眩胶囊可显著对抗缺氧造成的损伤,明显改善bEnd.3细胞的形态,使缺氧所致细胞凋亡数明显减少,促进bEnd.3细胞增殖,有效抑制缺氧诱导的bEnd.3细胞发生G1/S期阻滞,抑制MDA生成,增强SOD活性和NO、VEGF分泌。2.活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞的损伤具有明显的对抗作用,其机制与氧化应激、抑制细胞凋亡、促进血管内皮新生、炎症及免疫反应有关,活血定眩胶囊在基因水平通过多条通路调节血管内皮细胞功能。